微流控技術(shù)在細胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用
生命科學(xué)中持續(xù)的研究熱點之一是修飾(或者重編程)細胞基因組進而影響特定蛋白質(zhì)的合成、沉默某些基因、獲得選擇的細胞特性，其具體研究中必備的一項基礎(chǔ)技術(shù)是將外源核酸導(dǎo)入源核酸在物理化學(xué)性、代謝性方面克服質(zhì)膜與/或核膜等胞內(nèi)障礙，抵達并無損地整合到細胞中。其中，病毒介導(dǎo)的生物學(xué)途徑盡管有很高效率，但因為免疫性與毒性方面的安全問題，采用這種轉(zhuǎn)染技術(shù)越來越謹慎。
近十年來，眾多文獻持續(xù)探討、綜述細胞轉(zhuǎn)染的機制以及已有各種轉(zhuǎn)染技術(shù)的優(yōu)劣。在轉(zhuǎn)染機制的基礎(chǔ)研究方面，從細胞膜胞吞過程到細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)與載體之間的釋放機制與代謝途徑再到核質(zhì)傳輸過程，關(guān)注點是外源遺傳物質(zhì)在載體介導(dǎo)下進入細胞后的命運，為比較不同轉(zhuǎn)染技術(shù)效率提供理解基礎(chǔ)。顯然，不同技術(shù)背后所涉及的轉(zhuǎn)染過程很不相同，許多文獻綜述了特定技術(shù)途徑的發(fā)展現(xiàn)狀或其中的一些側(cè)面。例如，Escoffre等針對質(zhì)粒DNA在許多活體組織類型中的轉(zhuǎn)染方法的應(yīng)用及如何克服轉(zhuǎn)染障礙的現(xiàn)狀作了綜述。Rao等對脂介導(dǎo)途徑所涉及的細胞過程作了十分詳細的綜述與評論?；瘜W(xué)途徑中，納米粒子以及結(jié)合脂復(fù)合體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法發(fā)展迅速。物理途徑方面，Sophie等、Villemejane等先后作出較為全面的綜述；其中不同的具體技術(shù)，如電穿孔、聲穿孔、光穿孔等也有作者作出專門綜述。這方面，尤其令人注意的，電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)是一個熱點，先后有Golzio等、Favard等、Zaharoff等、Escoffre等、Fox等、Wang等從不同側(cè)面不同角度作出精彩評述或綜述。
在閱讀這些文獻過程中，我們注意到在細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)領(lǐng)域，朝著改進細胞轉(zhuǎn)染效率、提高安全性方向，近年來有逐漸向微型化技術(shù)途徑方面發(fā)展的趨勢。例如，轉(zhuǎn)染試劑納米化，在納米粒子輔助下以層層涂覆方式改善轉(zhuǎn)染，提出所謂納米級的基因載體(Nanovectors)；以微陣列方式點印核酸片段的表面上以常規(guī)轉(zhuǎn)染試劑孵育細胞，構(gòu)成轉(zhuǎn)染微陣列；尤其是，離體培養(yǎng)細胞的電穿孔技術(shù)出現(xiàn)了許多與微流控技術(shù)相結(jié)合的形式等。這些新發(fā)展，給我們從微尺度角度審視細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過程的新機會。一般地看，任何的轉(zhuǎn)染流程，在外源核酸分子或其與載體的復(fù)合物在進入胞內(nèi)之前，必須實現(xiàn)2個關(guān)鍵過程，一是要使核酸盡可能接觸到膜，二是要誘導(dǎo)細胞質(zhì)膜發(fā)生可逆變化，如使膜上能夠瞬間開孔(達成瞬間通透)，使外源核酸分子在該通透處進入到膜內(nèi)的細胞質(zhì)中。許多物理途徑如微注射等方法均是實現(xiàn)上述步驟而發(fā)展出的技術(shù)形式。因為細胞尺度、核酸及其載體尺度的限定，介質(zhì)的流動特性，使得以研究微尺度上的流動行為、流動控制或操縱為對象的新興微流控學(xué)正在成為實現(xiàn)上述過程的技術(shù)新角度。本文試圖對近年來涉及細胞轉(zhuǎn)染的微流控技術(shù)作出綜述，以期對此領(lǐng)域有一個全面的了解。
1微陣列方式的轉(zhuǎn)染技術(shù)
微陣列技術(shù)一般是在固態(tài)表面上以陣列化方式間隔排布相互作用體系中的一方，而另一方則以流動方式與陣列化的一方接觸，實現(xiàn)其中相互作用的完成。2001年Ziauddin和Sabatini[28]首次將這種技術(shù)方式應(yīng)用于細胞轉(zhuǎn)染。其做法是，將(相同或不同)質(zhì)粒DNA片段混溶在明膠溶液中，采用在DNA微陣列技術(shù)中發(fā)展的納升級點樣儀，在載玻片上點樣形成微陣列，待干化后，將這些質(zhì)粒DNA微點陣列浸浴于脂轉(zhuǎn)染試劑中，片刻后吸走脂轉(zhuǎn)染試液，并在這些微陣列上孵育動物細胞。這些細胞在貼壁生長過程中攝入其底部明膠微點中的質(zhì)粒DNA，分裂2~3次后在載玻片上形成由轉(zhuǎn)染細胞簇所組成的轉(zhuǎn)染細胞微陣列(Transfectedcellmicroarrays)，陣列微點的直徑約100~120?m(相互間隔300~400?m)，其中包含的轉(zhuǎn)染細胞數(shù)通常為30~80個。因為這種方式與常規(guī)的轉(zhuǎn)染做法在細胞與DNA加樣順序上相反，這些作者也將這種轉(zhuǎn)染技術(shù)稱為逆向轉(zhuǎn)染(Reversetransfection)。其中也可以將脂轉(zhuǎn)染試劑點樣操作之前加入在質(zhì)粒DNA的明膠溶液中。此方法的優(yōu)點是，由于轉(zhuǎn)染細胞簇之間間隔不到400?m，其陣列化排布的細胞簇密度是384孔板的200倍，大大地增加了轉(zhuǎn)染及后續(xù)分析通量，而且這種縮微對質(zhì)粒用量需求大為減少，被固化在明膠中的cDNA還可穩(wěn)定保存4個月。
近來，通過這種逆向轉(zhuǎn)染陣列方式構(gòu)建出RNAi微陣列，被應(yīng)用來系統(tǒng)地制備敲除基因的細胞，并進行喪失某些細胞功能的高通量篩選[31]，德國Sturzl等[32]對這一技術(shù)作了較為全面的綜述。
2縮微流動空間中的轉(zhuǎn)染
2.1簡單微通道
直微通道是微流控技術(shù)中最基本的構(gòu)件，但即使是這樣簡單的微尺度空間，也可以為細胞轉(zhuǎn)染提供可行的微環(huán)境。Li等[33]利用簡單微通道構(gòu)成的微空間來實施細胞的脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。PDMS通過與玻璃鍵和形成微管道，其長/寬/高分別為1cm/900μm/60μm。他們討論了在這樣一種簡易的微芯片裝置上利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將含有加強綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pEGFP-N2導(dǎo)入COS-7細胞的過程，并探討了最適宜的脂質(zhì)體濃度等問題。他們所用的裝置很簡單，構(gòu)成的芯片可以創(chuàng)造微環(huán)境來進行細胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染，其中在將細胞種植在微通道之前需要先用0.01％(W/V)Poly-L-Lysine(PLL，Sigma，USA)孵育通道以促進細胞的粘附。
轉(zhuǎn)染效率可以通過綠色熒光蛋白的表達確定。脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率與陽離子脂質(zhì)體和DNA的比率、陽離子脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)體顆粒的大小等有關(guān)。他們得出轉(zhuǎn)染效率會隨著脂質(zhì)體濃度的增大而提高，當含脂質(zhì)體為1μL的時候為COS-7細胞轉(zhuǎn)染的最適條件即高的轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率，當達到2μL的時候，微通道中細胞數(shù)量會急劇減少也就是細胞存活率很低但轉(zhuǎn)染效率卻很高。不過最適的轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率會隨質(zhì)粒DNA的純度和脂質(zhì)體的濃度而變化，另外質(zhì)粒必須是無內(nèi)毒素的，否則也會有很大的負面作用。這種陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法不需要太多的設(shè)備、特殊的芯片或是電極等，在一般實驗室可以方便地進行試驗。
2.2直微通道與微孔陣列的簡單結(jié)合
Nagamine等[34]實現(xiàn)了用微流控芯片對大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化，如圖1所示。所用的裝置由PDMS通道和一個硅襯底組成，PDMS微通道的長寬高分別為5.0mm/500μm/25μm，硅底片上有兩排錐形孔，微孔的大開口為400×400μm2，小開口為100×100μm2。兩者鍵合后，首先將質(zhì)粒DNA溶液通過微通道口加入并干燥于硅片上的錐形孔中，再將感受態(tài)細胞注入微通道中，從而使感受態(tài)細胞暴露于質(zhì)粒面前，之后經(jīng)過熱休克促進轉(zhuǎn)化后把上面的PDMS微通道剝離，硅底片在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以下的工作包括質(zhì)粒表達的鑒定和轉(zhuǎn)化效率等同傳統(tǒng)方法差不多，研究發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率也不同，可能緣于質(zhì)粒DNA長度和結(jié)構(gòu)的不同。
圖1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程
3微流控液滴技術(shù)應(yīng)用于細胞轉(zhuǎn)染
目前文獻可見有兩種利用液滴來實施細胞轉(zhuǎn)染。一是操縱液滴使其溶解混入基因片段，并投送給目標細胞；二是操縱液滴包封細胞，利用電穿孔方式進行轉(zhuǎn)染。
Wu等[35]利用微流控生成的微液滴作為轉(zhuǎn)染細胞的載體。他們首先制作了一個大小可調(diào)且產(chǎn)生的液滴均一(尺寸差別＜7.1％)的微流控芯片，在一個T型交叉微通道靠近交叉點的上方添加一個充有壓縮空氣的薄膜腔，通過空氣壓縮薄膜對液滴大小進行調(diào)節(jié)。在相同的連續(xù)相和分散相的流速比率下，施加在薄膜上的壓力越大產(chǎn)生的液滴越小，產(chǎn)生液滴的頻率越快，薄膜的調(diào)節(jié)由一個電磁閥開關(guān)和一個壓縮機控制。
完成了第一步即按需產(chǎn)生大小均一的液滴后，就為下一步的利用液滴轉(zhuǎn)染打下了基礎(chǔ)。液滴可以被用作載體將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入到COS-7細胞中，將脂質(zhì)的藥物依賴性抗體溶于鯊烯油中來產(chǎn)生液滴而表面帶負電的質(zhì)粒DNA可以結(jié)合在這些液滴的表面從而使液滴成為了載體。液滴由于重力作用會下沉到連接的培養(yǎng)皿底部進而增加了與細胞的接觸機會。當給COS-7細胞裂解物加入熒光素和ATP后，基因的轉(zhuǎn)染就可以通過發(fā)射光來表征。研究表明，液滴越小轉(zhuǎn)染效率越高，這源于液滴越小表面積對體積比值越大，能夠攜帶更多的DNA。但該工作有待完善的地方在于在實施細胞轉(zhuǎn)染時，該工作還沒有將形成DNA液滴與轉(zhuǎn)染過程實現(xiàn)集成。
Xiao等[36]同樣利用T型結(jié)構(gòu)的微流控裝置進行了液滴轉(zhuǎn)染，不過利用液滴的方法不同，他們是將細胞包到微液滴(直徑50μm左右)中后再進行電穿孔轉(zhuǎn)染，這可以有效避免傳統(tǒng)電穿孔的復(fù)雜過程，并能精確操縱細胞。另外其優(yōu)勢還在于：控制包埋細胞的液滴比水溶液中的單個細胞更容易和精確，能將電極處的電化學(xué)反應(yīng)降低到最低。Zhan等[37]亦在基于液滴的微流控芯片上實現(xiàn)了電穿孔轉(zhuǎn)染。這兩種方式的轉(zhuǎn)染都是將液滴作為了一個運輸載體，并達到了轉(zhuǎn)染的目的。
4微流控注射技術(shù)
毛細管微注射(Capillarymicroinjection)——其轉(zhuǎn)染是在顯微鏡下通過精密微操縱器將微注射針直接插入細胞的方式來實施的。
按照轉(zhuǎn)染試劑流控傳輸機制的不同，有兩種毛細管微注射方式，一種是利用毛細管壓差驅(qū)動(Capillarypressuremicroinjection，CPM)，另一種是基于動電原理的離子電泳(Ionophoresis)。毛細管微注射技術(shù)可以達到很高的轉(zhuǎn)染效率，細胞毒性也很低[38]。其中前一種方式，實現(xiàn)技術(shù)相對簡單，也很直接[8]，但是，毛細管壓差驅(qū)動方式的不足在于向細胞傳輸?shù)脑噭w積變動很大(甚至達5倍以上)，因此轉(zhuǎn)染結(jié)果可重復(fù)性差[39]，另外，注射量以及施加壓力對于注射針直徑大小有約束，現(xiàn)有商業(yè)化的微注射系統(tǒng)中，大多施加500kPa的壓力，相應(yīng)的微針尖端直徑被限制在200~500μm，顯然這一尺寸對于大多數(shù)細胞而言仍舊顯得太大。為了采用直徑更小的微針，有必要采用離子電泳方式來驅(qū)動試劑向細胞的傳輸。離子電泳是這樣來實現(xiàn)的，將一對微電極分別插入注射微針與細胞介質(zhì)中，兩電極施加電壓后誘導(dǎo)試劑電泳，顯然這就克服微注射對針尖直徑的限制[40]，但是這種轉(zhuǎn)染過程速度很慢，并依賴于所注射的試劑離子性質(zhì)，而且傳輸試劑的定量化仍舊存在問題[41]。無論哪種方式，轉(zhuǎn)染的通量與操作技術(shù)的復(fù)雜度也約束著這類技術(shù)的實用性。
圖2微流控芯片中的單細胞微注射系統(tǒng)
現(xiàn)在微流控技術(shù)有可能克服這一技術(shù)方式中存在著的上述諸多問題[42]。在微流控芯片上，可以把細胞微注射操作的前后過程如細胞培養(yǎng)、分類、可行性測試等集合在一起完成。如圖2a中實現(xiàn)了在微流控操縱下將細胞引導(dǎo)到接近固定的微注射針尖處，此時閥1打開閥2關(guān)閉；圖2b中細胞觸及微針尖，細胞膜被刺破形成穿孔，微注射即得以實現(xiàn)；圖2c中閥2打開閥1關(guān)閉時流體便會帶動細胞從通道B流到細胞收集器中。這樣的微流控操縱過程不僅實現(xiàn)了定點微注射[29]，也能減小由于細胞環(huán)境的改變而帶來的潛在危害。
5微流控電穿孔技術(shù)
電穿孔是指通過電場施加電脈沖后，在細胞膜表面會產(chǎn)生多個短暫細孔，分子可以被轉(zhuǎn)入或轉(zhuǎn)出細胞，電穿孔轉(zhuǎn)染便是將外源基因轉(zhuǎn)入細胞并進行表達。進行電穿孔轉(zhuǎn)染的微流控芯片各式各樣卻也大同小異，其基本上分為兩類：針對多細胞的和針對單細胞的電穿孔芯片。
5.1微流控芯片中的多細胞電穿孔
這類芯片轉(zhuǎn)染以Lin[14]設(shè)計的4種電穿孔微芯片最具有代表性和普遍性。Lin[14]利用MEMS技術(shù)設(shè)計制作了4種電穿孔微芯片來進行基因轉(zhuǎn)染。第1種是有微通道和平板電極的流動式電穿孔芯片(圖3a)，用于將質(zhì)粒導(dǎo)入懸浮細胞中，質(zhì)粒和細胞流入微通道中后用短暫電脈沖進行電穿孔；第2種是雙電極電穿孔芯片(圖3b)，主要用于粘附細胞的基因轉(zhuǎn)染；第3種是用成角度的叉指電極對雙電極電穿孔芯片的改進版(圖3c)，主要可以降低電壓和提高場強；第4種是整合了DNA預(yù)富集功能的叉指電極電穿孔芯片(圖3d)，是利用電泳吸引力可以增加細胞表面質(zhì)粒DNA的濃度并提高轉(zhuǎn)染效率。這4種芯片各有自己的特點，當然第4種的效果好些，不僅細胞和質(zhì)粒的需要量少，電穿孔電壓低，并且細胞的培養(yǎng)和準備過程也較簡單，還可以得到聚集的DNA。Lin通過實驗得出了第4種芯片的最適參數(shù)，即電極間距50μm、質(zhì)粒濃度80μg/mL、脈沖電壓6V、脈沖2Hz。在此條件下，將質(zhì)粒pEGFP-N1導(dǎo)入BCC(基底細胞癌的細胞株)的平均轉(zhuǎn)染效率達到35.89％。
芯片上的電穿孔需要利用電壓擊穿細胞膜，所以就要有不同的電壓產(chǎn)生電場來滿足實際需要。為此，Kim等[13]設(shè)計了一種多通道電穿孔微芯片，在這個芯片中有5個不同長度的微通道，所以能夠在一個芯片中在相同電壓下同時產(chǎn)生5種不同梯度的場強，也就相應(yīng)的有5種不同的轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率。這對于探索基因轉(zhuǎn)染的最佳條件更加方便和快速。
在將綠色熒光蛋白質(zhì)粒分別導(dǎo)入HEK-293細胞和CHO細胞后得到了各自最高表達的場強條件，而細胞轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率都比較高時的條件便是最佳條件，在最佳條件下轉(zhuǎn)染效率能超過80％并保證細胞存活率在70％以上。雖然高的電場強度更有利于基因進入細胞但卻會導(dǎo)致細胞死亡，使整體轉(zhuǎn)染效率降低。所以在這種多通道芯片中就能方便找到高轉(zhuǎn)染效率和高細胞存活率的并存的條件。另外，施加越高的電場，脈沖持續(xù)時間應(yīng)該越短或者相同時間內(nèi)連續(xù)的脈沖相比單一的脈沖更能得到高轉(zhuǎn)染效率和高細胞存活率。脈沖的波形也會對轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率產(chǎn)生影響。
一般電穿孔試驗中在金屬電極附近會產(chǎn)生氣泡、化學(xué)污染或是由于電極產(chǎn)生局部高溫造成細胞熱休克，這些對轉(zhuǎn)染都會有不良影響作用，為了解決這個問題，Kim等[12]利用聚二烯二甲基氯化銨溶液中(pDADMAC)離子的導(dǎo)電性來構(gòu)建鹽橋而避免了氣泡的產(chǎn)生。pDADMAC用來對微通道中細胞提供電勢差。pDADMAC的導(dǎo)電率約為16S/m，當輸入電壓為10V時可以產(chǎn)生0.9kV/cm的電場，這滿足電穿孔所需要的條件。利用此微流控裝置對人體的K562白血病細胞轉(zhuǎn)染時，輸入電壓15V，轉(zhuǎn)染效率可達到60％并且細胞存活率為80％，而在恒定的電勢差下每分鐘可以轉(zhuǎn)染約105個細胞，即也可以進行高通量的細胞轉(zhuǎn)染。
此外，Zhan等[37]提出了一種利用液滴進行電穿孔的方法，將細胞液滴形成在油相中，包含細胞的液滴隨油相流動到固定在下游通道某處的微電極表面，電極施加電壓時，可跨液滴使其內(nèi)細胞實現(xiàn)電穿孔。電穿孔的間隔時間和強度可根據(jù)液滴的尺寸(長約60~386μm)和流速(1.38~8.86m/min)決定，兩電極間距約20μm，施加電壓大小5~9V。
圖3四種電穿孔芯片
使用此裝置，他們將含有增強綠色熒光蛋白(EGFP)的質(zhì)粒成功地導(dǎo)入到CHO細胞中表達。雖然實驗中同時發(fā)現(xiàn)細胞存活率會隨著電壓的升高而降低，但是，利用操縱微液滴這種確定的微小空間實現(xiàn)將外源基因?qū)爰毎撵`活便利是顯而易見的。
Geng等[10]設(shè)計了一種流動式的電穿孔芯片，在恒定電壓下通過流動進行大量的細胞轉(zhuǎn)染，其中流速為20mL/min，轉(zhuǎn)染效率依然可以達到75％。同時設(shè)備簡單、價格低廉的特點也便于平普通實驗室的使用。Huang等[16]同樣利用流動式的電穿孔芯片達到高效轉(zhuǎn)染和操縱細胞的目的，并在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了單細胞的轉(zhuǎn)染，加載的細胞通過微流控通道可以逐個地被電通透到轉(zhuǎn)染點，實現(xiàn)對細胞的100％的操控率，也就可以對單個細胞進行轉(zhuǎn)染。Wang等[11]制作了一種蛇形半連續(xù)流動的芯片，在這種芯片里由于氣泡和焦耳熱產(chǎn)生的少，避免了細胞裂解產(chǎn)生過多的細胞碎片，使細胞的存活率超過50％，基因表達效率約為10％~15％。
芯片上進行電穿孔轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢在于PDMS的可透性給我們提供了可以看到轉(zhuǎn)染過程的機會。在電穿孔芯片上通過可視圖化研究，有利于更好理解電轉(zhuǎn)染的機制，提高我們對通道中細胞的原位實時監(jiān)測能力[15]。
5.2微流控芯片中的單細胞電穿孔
不同于多細胞電穿孔中的大量轉(zhuǎn)染，單細胞電穿孔中電場是施加于單個細胞的，許多大量轉(zhuǎn)染無法解決的問題可以由單細胞的電穿孔轉(zhuǎn)染來完成。Wang等[24]就曾針對這一方面進行過綜述。單細胞電穿孔可以用于基因和蛋白表達的高通量篩選，對于藥物發(fā)現(xiàn)、細胞內(nèi)在機制以及干細胞的研究都有重要意義。
人體THP-1(單核白血球)細胞在白血病的研究中有重要作用，但常規(guī)的轉(zhuǎn)染進行基因修復(fù)卻很難得到，并且進行大量的電穿孔轉(zhuǎn)染時絕大數(shù)這種細胞不能表達外來基因，細胞的存活率也相當?shù)?。Uitert等[44]設(shè)計了一種單細胞電穿孔微流控芯片來解決了這個問題，且提高了轉(zhuǎn)染效率。該芯片由兩條微通道組成，通道中間由9個細胞捕獲結(jié)構(gòu)連接。通道的一側(cè)為平板電極，另一側(cè)對應(yīng)的是9個寬度與細胞直徑相當?shù)碾姌O。當細胞樣從進樣口加入后，在兩電極之間被捕獲，而此種結(jié)構(gòu)可以一次性對9個單細胞同時電穿孔，因此有利于進行高通量的單細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率也相應(yīng)提高。
此外，Cho等[45]提出了一種3D的單細胞電穿孔芯片，該芯片是由一條通道和用于產(chǎn)生電場的懸臂式微電極對組成，其中微通道的尺寸是：長4mm、寬10~40μm、深20μm，雙懸臂梁之間的間距是10~20μm，與靶細胞的尺寸相當。這種電極裝置的特點是可以將低電壓放大并可在兩電極之間捕獲單個細胞，因此樣本細胞從入口處經(jīng)由微通道到達兩電極之間時，細胞膜便在此處被放大的電壓擊穿形成穿孔。這樣細胞在電穿孔過程中受到的損傷很小，轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率也就相應(yīng)增高。這種芯片的特點是：所需電壓更低；有不均勻的電場；電極與細胞間的間距更小。當在兩個電極之間施加0.7V的電壓時在尖端的最大場強可以達到3×104V/m。當流動的細胞連續(xù)加入該電穿孔芯片時可以進行高通量的電穿孔轉(zhuǎn)染。
而當前，干細胞的研究是一個熱點，即把人體骨髓間質(zhì)干細胞(MSCs)的基因修復(fù)用于自身修復(fù)或他人移植，而將干細胞與微流控芯片結(jié)合起來探討，也是現(xiàn)在研究中的一個趨勢。Valero等[46]就在微流控裝置中利用單細胞的電穿孔研究了干細胞中的基因轉(zhuǎn)染和蛋白質(zhì)動力學(xué)。他們通過實驗得出在微流控裝置中不僅可以高效地轉(zhuǎn)染MSCs，還可以保持細胞的生存能力和對其生存環(huán)境改變作出反應(yīng)的能力。這對于比較稀少且作為有限的人類生命源泉的MSCs來說，是非常重要的。通過呈現(xiàn)細胞微環(huán)境中的生長因素和對細胞內(nèi)部蛋白質(zhì)動力學(xué)高分辨率的成像，可達到操縱單個細胞的目的。
微流控芯片上的單細胞電穿孔可以避免大量電穿孔時已經(jīng)轉(zhuǎn)染的和沒有轉(zhuǎn)染的細胞混合在一起后的分離，這樣也就沒有必要去鑒別細胞是否轉(zhuǎn)染。同時，單細胞電穿孔對細胞的損傷更小，并且所用細胞和反應(yīng)試劑的量也更少。而微流控芯片可以用于單個細胞的獲取和阻抗的測量[47-48]，利用微電極的電阻抗微芯片可以有利于細胞轉(zhuǎn)染過程的評估[49]。不僅如此，微流控芯片還可以將靶細胞定位在特定位點上[50]，利用單細胞電穿孔技術(shù)操縱組織切片、細胞培養(yǎng)中的單個靶細胞，從而也為靶細胞的遺傳、代謝、合成開啟了一扇新的窗戶。
6.微流控條件下細胞轉(zhuǎn)染效率的影響因素及改善途徑
長期以來的轉(zhuǎn)染實驗，人們已經(jīng)認識到約束轉(zhuǎn)染效率提高的因素，例如：DNA質(zhì)量的好壞、轉(zhuǎn)染方法的不同等，但在微條件下的相同轉(zhuǎn)染方法中，細胞包被物[51-52]、流動因素[53-54]、微通道寬度、比表面積[23,54]等也會對轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生很大影響。
Uchimura等[51]通過對PC12細胞在微流控芯片上轉(zhuǎn)染的研究，認為IV型膠原作為一種合適的表面涂層物對于PC12細胞轉(zhuǎn)染得到高的轉(zhuǎn)染效率是非常便利的，而纖連蛋白對局部轉(zhuǎn)染效率有重要作用。同時Yoshikawa等[52]通過對人體骨髓間充質(zhì)干細胞在微陣列上的轉(zhuǎn)染也發(fā)現(xiàn)纖連蛋白可以明顯提高細胞在芯片上的轉(zhuǎn)染效率。對于一些難轉(zhuǎn)染的細胞，在其細胞表面包被一層細胞外基質(zhì)可以顯著提高轉(zhuǎn)染效率。
在微通道中進行細胞轉(zhuǎn)染，細胞處于懸浮(流動)，處于固定(靜止)，在這兩種狀態(tài)下轉(zhuǎn)染效率是不一樣的。分子信標在靜態(tài)的微通道中的轉(zhuǎn)染效率要比傳統(tǒng)在細胞培養(yǎng)皿中的低[54]。在流動狀態(tài)下會受到其他一些因素的影響。為此，Li等[53]通過模擬計算和試驗兩種方式比較了在傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)皿中和微流控細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中有或沒有流動因素對分子信標轉(zhuǎn)染效率的影響。通過對比細胞培養(yǎng)皿和靜態(tài)的微流控系統(tǒng)中細胞的轉(zhuǎn)染，得出分子信標的轉(zhuǎn)染受制于擴散和反應(yīng)；而對微流控系統(tǒng)施以一定的范圍的流體剪應(yīng)力和傳質(zhì)速率后，較大的流體剪應(yīng)力會破壞轉(zhuǎn)染試劑/分子信標混合物與細胞膜的結(jié)合，并且占主導(dǎo)作用以至于超過加強的傳質(zhì)。也就是說，在靜態(tài)的微通道中，每個細胞可用的轉(zhuǎn)染試劑/分子信標混合物的量會由于微通道高度的限制而少于傳統(tǒng)培養(yǎng)皿中的量，因而轉(zhuǎn)染效率也低。而在流動的微通道中，流體剪應(yīng)力會對轉(zhuǎn)染起負面作用，因為流體剪應(yīng)力能夠去除掉細胞膜表面的轉(zhuǎn)染試劑/分子信標混合物，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。
利用電穿孔芯片技術(shù)進行轉(zhuǎn)染，需要注意所使用的脈沖電壓。當使用指數(shù)衰退型脈沖電機時，電轉(zhuǎn)染會受到微通道寬度的影響，因為電壓脈沖的波形會受影響而變化[13-14]。而在微通道中比表面積相對較大，所以可以使每個單位表面的熱量更快地分散[23]。這可以盡量減少細胞的死亡，以余存更多的細胞進行轉(zhuǎn)染，提高總轉(zhuǎn)染效率。
除此之外，將DNA與磁性納米粒子結(jié)合可以在磁場條件下被吸引到細胞表面的特定區(qū)域，從而可以大大提高該特定區(qū)域的DNA的濃度。相對于電場條件下的靜電吸引力，磁電穿孔中的磁引力可以有更高的轉(zhuǎn)運效率(63.5％對沒有任何引力時的31.45％)，這樣轉(zhuǎn)染效率也就大大提高[7]。同樣，用21個堿基巰基寡核苷酸修飾的金納米顆粒做運輸載體，不但可以用紫外線來檢測運輸效率，并且在電穿孔中結(jié)合有納米顆粒的轉(zhuǎn)運效率也相對更高[55]。
相似的是合理利用電場也會有如上磁場的效果。利用圖3c中的微流控裝置，當正極連通其中的一個電極后，DNA由于帶負電荷所以會被吸引積聚到陽極上，也就增加了這個電極的DNA濃度，然后再打開電源開關(guān)進行電穿孔。這也就是通過電場吸引力將DNA引到特定位點后進行轉(zhuǎn)染，如此細胞表面的DNA濃度會達到普通電穿孔的數(shù)千倍，進而基因轉(zhuǎn)染效率相比沒有電場吸引力的6.3倍之高。這種方法對基因治療的特定位點的基因修復(fù)提供了一個研究平臺[43]。
7結(jié)語
將微流控技術(shù)與生命科學(xué)中的熱點結(jié)合起來研究是現(xiàn)在的一個趨勢，相對于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法，利用微流控技術(shù)進行轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢是顯而易見的。首先，比傳統(tǒng)的方法耗費溶劑和反應(yīng)試劑量少，并且所需細胞樣體積也非常小，這對于某些較難得到的細胞來說是非常重要的，而轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率也相對較高。其次，微流控環(huán)境更接近于細胞的直徑大小，有利于單個細胞研究，而這種微環(huán)境也可以有效模擬體內(nèi)細胞生長的微環(huán)境，對研究細胞及其小生境或是細胞在體外的分離培養(yǎng)有重要意義。再次，微流控環(huán)境可以進行原位可視觀察和實時監(jiān)測，對于整個轉(zhuǎn)染過程可以有更好的把握，進而有利于轉(zhuǎn)染機制的研究。最后，利用微流控技術(shù)進行細胞轉(zhuǎn)染可以與微流控技術(shù)中的其他許多技術(shù)相結(jié)合，如細胞操縱[10,16,36]、細胞傳感[56]、PCR反應(yīng)[57]及電泳[58]等。
總之，微流控技術(shù)帶來了巨大的多功能性，它能夠促進傳統(tǒng)細胞生物研究和基因組數(shù)據(jù)的整合，為系統(tǒng)的基因研究提供研究平臺，并在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測和藥物開發(fā)等領(lǐng)域帶來新的啟示和重要應(yīng)用。
文獻鏈接：
徐海明，蔣稼歡.微流控技術(shù)在細胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用.生物工程學(xué)報,ISSN 1000-3061
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