中國有句諺語，“工欲善其事，必先利其器”，為了闡明細(xì)胞的生命過程，需要特殊的工具。

細(xì)胞作為生命組成的最小單元，研究其相關(guān)的生物行為及其規(guī)律與本質(zhì)，對(duì)于揭示生命的奧秘，探索疾病的機(jī)理與治療手段，提高人類的生存壽命與質(zhì)量，都有著重要的意義。

對(duì)細(xì)胞的研究是一個(gè)復(fù)雜的工程，細(xì)胞在人體內(nèi)處于復(fù)雜的微環(huán)境之中，包括溫度、氧氣濃度、生物因子濃度、機(jī)械作用、細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞基質(zhì)間相互作用等，同時(shí)，細(xì)胞體積微小、種類多樣，在細(xì)胞水平進(jìn)行細(xì)胞識(shí)別、代謝物檢測、內(nèi)部組分分析、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能表征、細(xì)胞間相互作用分析等工作也都有著很大的難度。

微流控（microfluidics）指的是使用微通道（尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米）處理或操縱微小流體的系統(tǒng)所涉及的科學(xué)和技術(shù)，是一門涉及化學(xué)、流體物理、微電子、新材料、生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程的新興交叉學(xué)科。

因?yàn)榫哂形⑿突?、集成化等特征，微流控裝置通常被稱為微流控芯片（microfluidic chip），又稱微全分析系統(tǒng)（micro total analysis system，μTAS）或者芯片實(shí)驗(yàn)室（lab on a chip，LOC），于20世紀(jì)90 年代初開始引起人們的關(guān)注。微流控技術(shù)因具有一系列優(yōu)點(diǎn)，如樣品試劑消耗少、結(jié)構(gòu)功能多樣化、集成化程度高、與細(xì)胞尺度接近等，近年來被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞相關(guān)領(lǐng)域的研究，包括細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞捕獲、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞融合、藥物代謝、細(xì)胞通信、組織工程等，通過結(jié)合不同的分析檢測方法以及集成不同的功能操作單元，取得了巨大的研究進(jìn)展，解決了很多傳統(tǒng)方法無法解決的問題。但是，如何在微流控芯片內(nèi)更加高效簡便地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操控定位，如何更好地模擬細(xì)胞在生命體內(nèi)的生物微環(huán)境，從而進(jìn)行體外生物系統(tǒng)的構(gòu)建，用于生命醫(yī)療疾病的研究，仍然需要在相關(guān)技術(shù)、材料、方法等方面做出更深入的研究。

《微流控芯片細(xì)胞分析》的英文版本由國際知名出版商Springer于2017年出版，問世后兩個(gè)月下載3000次，位列該年度top10。

該書從第1 章“微流控芯片的設(shè)計(jì)和制作”，至最后的第13 章“基于微流控技術(shù)的微生物學(xué)研究”，許多內(nèi)容來自作者實(shí)驗(yàn)室的研究成果或者科研經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，深入淺出，簡單易懂。書中章節(jié)既有獨(dú)立性又有相關(guān)的參考性，以正在從事微流控芯片或者細(xì)胞分析研究的科研工作者以及開展博士論文或者碩士論文研究的研究生為讀者對(duì)象，盡最大可能地收集與每一章節(jié)有關(guān)的參考文獻(xiàn)。作者希望本書能夠幫助渴望了解更多有關(guān)微流控芯片和細(xì)胞分析相關(guān)知識(shí)的研究者和學(xué)生，并與所研制的細(xì)胞分析微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用儀器進(jìn)行配套，推動(dòng)微流控技術(shù)的快速發(fā)展。

單細(xì)胞分析與微流控技術(shù)

大多數(shù)真核細(xì)胞都是單一的個(gè)體，但是在進(jìn)化過程中，它們已經(jīng)可以互相關(guān)聯(lián)并密切相互作用形成組織、器官，甚至整個(gè)植物或者動(dòng)物。然而，單細(xì)胞分析通常只關(guān)注組織或者器官中的單個(gè)細(xì)胞。即使在相同的培養(yǎng)條件下，同源細(xì)胞在單細(xì)胞層面上也會(huì)具有形態(tài)、基因表達(dá)水平以及生長特性上的差別。

此外，單細(xì)胞分析對(duì)于細(xì)胞內(nèi)生命過程的機(jī)理解釋具有重要的作用。當(dāng)我們研究單個(gè)細(xì)胞，試圖理解它們?nèi)绾卧谏锵到y(tǒng)中發(fā)揮作用時(shí)，可以了解生命系統(tǒng)的發(fā)展，生命的成長和特殊化，以及單個(gè)細(xì)胞和整個(gè)生物體的進(jìn)化。如果我們能在分子水平上理解生命現(xiàn)象，也許可以理解在細(xì)胞上的細(xì)微差別誘導(dǎo)生物現(xiàn)象如學(xué)習(xí)和記憶，或者了解細(xì)胞的微小改變導(dǎo)致疾病或者生命功能障礙，如癌癥。

為了開發(fā)新型的針對(duì)細(xì)胞層面的治療干預(yù)措施，對(duì)于生物異質(zhì)性及物質(zhì)傳輸通道的理解就變得尤其重要，這些研究會(huì)應(yīng)用到罕見但重要的細(xì)胞類型，如干細(xì)胞或祖細(xì)胞。由此，開發(fā)出了廣泛而多樣的單細(xì)胞分析研究方法，以分析它們的形態(tài)和生理特征，同時(shí)獲得分子、基因、轉(zhuǎn)錄和定量生物化學(xué)信息，甚至在模擬生物體內(nèi)條件的狀態(tài)下監(jiān)視細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)，在功能齊全的生物體內(nèi)，單個(gè)細(xì)胞可以被標(biāo)記和追蹤，最終實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞原本無干擾的自然環(huán)境中得到分析研究。

目前，單細(xì)胞分析面臨的挑戰(zhàn)是單個(gè)細(xì)胞的尺寸很小，因此分析技術(shù)必須能夠用于微量的樣本分析。然而，為了獲得足夠的有效的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)應(yīng)該實(shí)現(xiàn)高通量，同時(shí)實(shí)驗(yàn)成本還應(yīng)該降低，以讓更多實(shí)驗(yàn)室能夠在經(jīng)濟(jì)上負(fù)擔(dān)得起。在過去的幾年里，巨大的技術(shù)發(fā)展可以實(shí)現(xiàn)在所有領(lǐng)域的單細(xì)胞分析。單細(xì)胞分析是對(duì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯、調(diào)控等內(nèi)部信號(hào)在單個(gè)細(xì)胞條件下分子水平的測量，其目標(biāo)是從單個(gè)細(xì)胞層面上分析以全面地理解細(xì)胞種群。這個(gè)方法讓研究人員從分子的角度揭開單細(xì)胞與組織、器官甚至生命體的行為之間的聯(lián)系。單細(xì)胞分析技術(shù)在過去的十多年里獲得重要的發(fā)展，大量相關(guān)的科研工作得以發(fā)表。

單細(xì)胞分析研究領(lǐng)域正迅速地發(fā)展，許多研究從之前的大量細(xì)胞分析轉(zhuǎn)變?yōu)閱渭?xì)胞分析，這得益于對(duì)單細(xì)胞的異質(zhì)性和隨機(jī)性的研究。這些細(xì)胞種群的隨機(jī)變化可能是受種群內(nèi)在的影響。不同細(xì)胞個(gè)體在轉(zhuǎn)錄、翻譯等活動(dòng)中存在差異，使得細(xì)胞內(nèi)的離子、mRNA 和蛋白等物質(zhì)表現(xiàn)出細(xì)胞間的異質(zhì)性。

由于細(xì)胞膜的靈活性和動(dòng)態(tài)特性，反應(yīng)和分子碰撞會(huì)隨機(jī)發(fā)生。因此，在一個(gè)細(xì)胞種群中所有細(xì)胞在任何時(shí)刻都會(huì)存在一定的差異，只有大量的單細(xì)胞分析測試才能揭示它們的異質(zhì)性并提供統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，同時(shí)建立模型。在微流控技術(shù)發(fā)展的過程中，樣品前處理分析規(guī)模被微型化，使得樣品處理更加簡單方便。如今，微流控系統(tǒng)已經(jīng)可以應(yīng)用于廣泛的單細(xì)胞研究中。鑒于微流控技術(shù)的作用在單細(xì)胞分析中越來越明顯，可以預(yù)計(jì)不斷持續(xù)發(fā)展的微流控技術(shù)會(huì)更好地促進(jìn)單細(xì)胞分析的發(fā)展。

基于微流控芯片的生物組織解離方法

傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)需要在固定的時(shí)間點(diǎn)更換培養(yǎng)基，這樣可以持續(xù)為細(xì)胞提供營養(yǎng)，從而維持營養(yǎng)物質(zhì)和排泄物濃度在整個(gè)細(xì)胞的生命周期中保持穩(wěn)定。為了更好地創(chuàng)建一個(gè)模擬體內(nèi)組織流動(dòng)的環(huán)境，Hattersley 等設(shè)計(jì)了一種微流控裝置，在芯片上灌注培養(yǎng)、分析、解離完整的鼠的肝組織，如圖1（a）所示。

實(shí)驗(yàn)過程簡述如下：使用乙二醇四乙酸（EGTA）灌注固定的組織以清除Ca²⁺，然后灌注伯爵平衡鹽溶液（EBS）以清除EGTA，防止膠原酶被抑制。接下來，灌注膠原酶消化組織。最后，以高流速（500 μL/min）快速灌注冰冷的分散緩沖劑。被沖下來的分散的細(xì)胞可以直接在芯片的輸出口收集到離心管中。這種利用微流控芯片的組織解離方法可以減少組織或細(xì)胞暴露在未消毒的環(huán)境下的時(shí)間，從而減少污染的風(fēng)險(xiǎn)。然而由于解離時(shí)間較長，此方法并不適合在基因表達(dá)分析中使用。為了嚴(yán)格實(shí)現(xiàn)從生物組織中分離單細(xì)胞，Lin 等設(shè)計(jì)了一個(gè)微流控細(xì)胞解離芯片（μCDC）。這個(gè)芯片由50 μm 寬、167 μm 高、間距20 μm 的多個(gè)微柱組成，如圖1（b）和（c）所示。在這個(gè)工作中，將含有小鼠大腦腫瘤細(xì)胞DC115 和KT88 的神經(jīng)球組織用注射泵以3～15 mL/min的速率通過設(shè)計(jì)的微柱陣列后，最終解離成單個(gè)細(xì)胞。通過μCDC 芯片處理得到單細(xì)胞的產(chǎn)率在81%～85%之間，其中具有活性的單細(xì)胞產(chǎn)率在80%～85%之間。這個(gè)方法在解離生物組織時(shí)相比傳統(tǒng)的研磨法具有高產(chǎn)率的優(yōu)勢，細(xì)胞經(jīng)過芯片解離后，存活率會(huì)更高。然而由于機(jī)械分離的固有缺陷，分離的速率較慢。

圖1 （a）可以進(jìn)行組織整體培養(yǎng)和解離的芯片[21]；（b）通過軟光刻技術(shù)及PDMS 制備的單通道μCDC 芯片；（c）生物組織通過微柱機(jī)械地分離為單個(gè)細(xì)胞的SEM 照片；（d）經(jīng)由芯片進(jìn)行組織解離的芯片示意圖

基于微流控技術(shù)的細(xì)胞分選方法

微流控細(xì)胞分選技術(shù)的出現(xiàn)突破了熒光激活細(xì)胞分選法和磁激活細(xì)胞分選法的一些限制。相比于傳統(tǒng)的細(xì)胞分選方法，微流控裝置本質(zhì)上更有利于細(xì)胞分選。微流控設(shè)備微型化的特點(diǎn)，使得在實(shí)驗(yàn)操作中試劑消耗量降低，同時(shí)提高了便攜性；制造微流控芯片可以使用標(biāo)準(zhǔn)的制造體系和軟光刻技術(shù)，大大降低了生產(chǎn)成本；在微流控芯片中簡化了實(shí)驗(yàn)的操作步驟，同時(shí)還減少了細(xì)胞樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)。

然而，微流控細(xì)胞分選需要進(jìn)一步發(fā)展才能取代傳統(tǒng)的細(xì)胞分選技術(shù)。微流控系統(tǒng)相比商業(yè)流式細(xì)胞儀的主要缺點(diǎn)是分選通量和效率低。因此，提高其實(shí)驗(yàn)效率是當(dāng)前的一個(gè)研究重點(diǎn)。另外，通過軟光刻技術(shù)制造的微流控裝置在實(shí)驗(yàn)中容易導(dǎo)致細(xì)胞黏附和堵塞，影響了它的使用壽命。

單細(xì)胞提取

微流控裝置在單細(xì)胞提取中具有許多優(yōu)勢。由于核糖核酸等生物分子在細(xì)胞中的含量可低至0.01～2.5 pg/單個(gè)細(xì)胞，這要求盡可能少地對(duì)提取出的單細(xì)胞進(jìn)行稀釋。在微流控芯片中，每個(gè)單細(xì)胞通過芯片內(nèi)的固定結(jié)構(gòu)被分隔在不同的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域通過微型化以減少裂解產(chǎn)物稀釋，這對(duì)于分析低含量的生物分子十分關(guān)鍵。微流控系統(tǒng)所消耗的試劑體積小，從而降低了實(shí)驗(yàn)成本。提取出的單細(xì)胞可以通過顯微鏡可視化操作緊密排列。此外，大多數(shù)微流控系統(tǒng)完全是自動(dòng)、封閉系統(tǒng)，減少了樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)。

單細(xì)胞裂解

微流控系統(tǒng)為單細(xì)胞裂解提供了一個(gè)理想的平臺(tái)，由于芯片可以制造成特定的幾何形狀并且可以具有精確的尺寸大小，可以避免單細(xì)胞裂解中其他細(xì)胞的干擾。微流控芯片的長度與單個(gè)細(xì)胞相匹配從而使得稀釋程度最小化以增加檢測靈敏度。大部分芯片是光學(xué)透明的，允許可視化操作。微流控單細(xì)胞裂解方法有很多種，每種方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)，這將在接下來的部分討論。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)影響因素，選擇合適的技術(shù)對(duì)于裂解的結(jié)果是至關(guān)重要的。

圖2 微流控芯片中利用機(jī)械力裂解單細(xì)胞的原理圖

單細(xì)胞分析檢測

單細(xì)胞分析的最后一個(gè)步驟是單細(xì)胞分析檢測。將細(xì)胞通過之前一系列步驟—組織解離、細(xì)胞分選、單細(xì)胞分離、單細(xì)胞裂解提取出所需要分析的物質(zhì)后，最后一步就是通過特定的方法對(duì)這些分子進(jìn)行檢測和表征，進(jìn)而得到所需要的細(xì)胞信息等。目前常用的單細(xì)胞分析手段主要包括熒光成像、電化學(xué)分析及質(zhì)譜分析三種方法。

1.單細(xì)胞熒光成像

在很長一段時(shí)間內(nèi)，熒光成像是使用最普遍的單細(xì)胞分析方法，它在單細(xì)胞分析研究中有著至關(guān)重要的作用。單細(xì)胞熒光成像在細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的檢測方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢。它能夠提供具有高對(duì)比度的化學(xué)物質(zhì)專一性圖像，并且能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)的活體成像。盡管熒光成像具有上述優(yōu)勢，但是它要求目標(biāo)分子能夠產(chǎn)生熒光。對(duì)于本身沒有熒光的分子，需要通過化學(xué)標(biāo)記或基因標(biāo)記的手段使其帶上能夠發(fā)光的熒光官能團(tuán)，這在一定程度上限制了熒光成像的應(yīng)用。發(fā)展新的熒光標(biāo)記方法一直是熒光成像的研究熱點(diǎn)。另外，標(biāo)記對(duì)代謝物分子本身的性質(zhì)有一定的影響，尤其是小分子代謝物。由于光譜重疊的問題，單細(xì)胞熒光成像也很難對(duì)多種代謝物進(jìn)行同時(shí)成像。

2.單細(xì)胞電化學(xué)分析 

電化學(xué)方法能夠?qū)渭?xì)胞中的代謝物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測。以電化學(xué)方法在神經(jīng)科學(xué)上的研究為例，Adams在20 世紀(jì)70 年代對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)方面的研究開創(chuàng)了這方面的先河。目前，電化學(xué)方法在單細(xì)胞分析上的應(yīng)用已經(jīng)不再局限于神經(jīng)遞質(zhì)的研究，而是拓展到了細(xì)胞內(nèi)的各種小分子或者大分子的研究。然而與熒光成像方法類似，電化學(xué)方法也難以實(shí)現(xiàn)多組分的同時(shí)檢測。

3.單細(xì)胞質(zhì)譜分析

質(zhì)譜是一種很適合于單細(xì)胞分析的檢測方法。它具有極高的靈敏度，能夠?qū)Χ喾N物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行檢測，而且具有對(duì)所感興趣的分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的能力。目前，人們已經(jīng)發(fā)展出了多種離子化方法，這些方法能夠?qū)Σ煌愋偷臉悠愤M(jìn)行解吸附/離子化，主要包括電噴霧/納米電噴霧離子化（ESI/nano-ESI）、激光剝蝕/激光解吸附離子化（LA/LDI）及二次離子化質(zhì)譜（SIMS）等。這些離子化方法能用于對(duì)不同種類的物質(zhì)進(jìn)行離子化，如蛋白質(zhì)、多肽、酯類、小分子代謝物及元素等。由于單細(xì)胞質(zhì)譜分析無需標(biāo)記，且能夠進(jìn)行多組分的同時(shí)分析，因而在近年來的單細(xì)胞研究中逐漸受到關(guān)注。

單細(xì)胞分析是一個(gè)新興且迅速擴(kuò)張的研究領(lǐng)域，在這個(gè)領(lǐng)域中不斷有新技術(shù)的出現(xiàn)，這使得人們很難預(yù)測領(lǐng)域內(nèi)未來的關(guān)注點(diǎn)和應(yīng)用。然而，不可否認(rèn)的是，創(chuàng)新的微流控技術(shù)已經(jīng)在單細(xì)胞分析領(lǐng)域中做出了巨大的貢獻(xiàn)并將持續(xù)發(fā)揮重要的作用。在未來，很可能會(huì)出現(xiàn)更多用于組織分離的微流控裝置。然而，用于組織分離的微流控技術(shù)依然不如用于細(xì)胞分選的技術(shù)成熟，這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的組織分離方法是最廉價(jià)和有效的。相比之下，細(xì)胞分選仍然由經(jīng)濟(jì)因素驅(qū)使，往往是需要隔離的稀有細(xì)胞群通過細(xì)胞分選的過程來富集。那么這個(gè)步驟就需要一個(gè)簡單、低成本、高通量的細(xì)胞分選系統(tǒng)，而這正是微流控裝置的優(yōu)勢所在。因此，我們預(yù)計(jì)微流控細(xì)胞分選領(lǐng)域的研究工作將會(huì)繼續(xù)增多。

現(xiàn)代的單細(xì)胞分析技術(shù)尤其令人興奮。在擴(kuò)增、測序和微流控方面的技術(shù)進(jìn)步使得我們可以通過前所未有的方式探測生命的基本單位—細(xì)胞。單細(xì)胞分析會(huì)在癌癥、免疫學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、干細(xì)胞等研究中產(chǎn)生持久的影響。目前，研究人員通過將細(xì)胞從其生長的微環(huán)境轉(zhuǎn)移到分析緩沖區(qū)中研究單細(xì)胞。因此，細(xì)胞的原生環(huán)境的影響完全被剝離出來，而且細(xì)胞分析的過程也是不可逆轉(zhuǎn)的變化。人們普遍認(rèn)為細(xì)胞的生長環(huán)境對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的分子信號(hào)具有重大的影響，這也促進(jìn)了微流控芯片在模擬生物內(nèi)環(huán)境的同時(shí)進(jìn)行單細(xì)胞分析工作的發(fā)展。

微流控裝置相比傳統(tǒng)的單細(xì)胞分析裝置在實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞多參數(shù)測量時(shí)有更大的潛力且有更快的測試速度。然而，微流控裝置的靈敏度和特異性仍然需要改進(jìn)。在未來，微流控技術(shù)的發(fā)展將會(huì)帶來更多的應(yīng)用，使得單細(xì)胞分析領(lǐng)域繼續(xù)向前推進(jìn)。

本文摘編自林金明著《微流控芯片細(xì)胞分析》之文前及第八章，內(nèi)容有刪減。