文章來(lái)源：周子琦, 李舒婷, 田杰生, 賀萬(wàn)崇, 許文濤. 趨磁細(xì)菌改造及磁小體功能化的研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2019, 35(4): 139-150

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摘要：趨磁細(xì)菌(Magnetotactic bacteria，MTB)是一種可在外磁場(chǎng)作用下沿磁場(chǎng)線定向運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性菌，其體內(nèi)的磁小體(Bacterial magnetosomes，BMs)是由MTB經(jīng)過(guò)生物礦化合成的。BMs在MTB體內(nèi)成鏈狀排列，由外層膜和內(nèi)部磁鐵礦晶體構(gòu)成。BMs具有大小均一，單磁疇，大的比表面積，良好的生物相容性，超順磁性等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。目前，基于MTB的改造方法相對(duì)較少且主要偏向于通過(guò)改變BMs的形態(tài)、組成等進(jìn)一步達(dá)到改造MTB的目的。BMs的功能化策略相對(duì)較多，主要分為化學(xué)修飾和生物修飾兩種。綜述了MTB和BMs的基本特性及篩選技術(shù)，并著重介紹了MTB的改造方法和BMs的功能化策略，最后討論了MTB改造和BMs功能化在實(shí)際應(yīng)用中的意義以及存在的問(wèn)題。展望了MTB改造和BMs功能化的發(fā)展前景，可能面臨的機(jī)遇及挑戰(zhàn)，以期能夠進(jìn)一步促進(jìn)MTB和BMs在實(shí)際中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：趨磁細(xì)菌,改造,磁小體,功能化

趨磁細(xì)菌(Magnetotactic bacteria，MTB)是一種依靠體內(nèi)生物礦化所產(chǎn)生的磁性納米顆粒，能夠在外磁場(chǎng)的作用下定向運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性菌[1-2]，一般為微好氧或厭氧型。其內(nèi)部的磁性納米顆粒為磁小體(Bacterial magnetosomes，BMs)，在MTB體內(nèi)組裝成長(zhǎng)鏈狀，沿菌體長(zhǎng)軸排列，在外磁場(chǎng)中引導(dǎo)菌體的運(yùn)動(dòng)。目前，MTB主要存在于細(xì)菌域的五大譜系內(nèi)，其中3個(gè)屬于變形桿菌門(mén)，分別是α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)和δ-變形桿菌綱(Deltaproteobacteria)，剩下兩個(gè)分別屬于Latescibacteria門(mén)和Omnitrophica門(mén)[3]。此外還有未被培養(yǎng)的MTB屬于硝化螺旋菌門(mén)[4]。2017年，Liu[5]等在海底馬里亞納火山沉積物中發(fā)現(xiàn)了16種新型MTB，證實(shí)了MTB的種類多樣性與其在進(jìn)化中的生物礦化密不可分。

BMs主要由外層脂質(zhì)膜和內(nèi)部磁鐵礦晶體構(gòu)成，BMs的外膜由MTB細(xì)胞膜內(nèi)陷生成。磁鐵礦晶體形態(tài)多樣，大小均一，為單磁疇納米顆粒，具有較好的生物相容性、磁控性、磁熱性、超順磁性和較低的毒性。

目前有關(guān)MTB的改造工作主要基于改變菌體內(nèi)BMs的形態(tài)、組成等達(dá)到間接改造MTB的目的，且主要通過(guò)化學(xué)修飾和物理修飾這兩種策略對(duì)BMs進(jìn)行功能化，進(jìn)而在BMs表面修飾抗體、核酸、藥物等多種物質(zhì)應(yīng)用于生物傳感和癌癥治療等多個(gè)領(lǐng)域。當(dāng)前用于BMs磁性檢測(cè)的手段主要有Schüler等[6]的Camg法和在Camg法基礎(chǔ)上改進(jìn)的Ramg法[7]。在生物傳感方面，與人工合成的磁性納米粒子相比，BMs的應(yīng)用主要局限于在膜的表面修飾上抗體，利用抗原抗體特異性免疫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，形式比較單一。

1 趨磁細(xì)菌的基本特性及特點(diǎn)

1.1 趨磁細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組成及基本特性

MTB通常是微好氧或者厭氧型的革蘭氏陰性菌，具有叢生、一端或兩端生的鞭毛[5]，可以在外磁場(chǎng)的作用下沿磁感線方向運(yùn)動(dòng)。目前研究發(fā)現(xiàn)的MTB的種類與其所處環(huán)境有一定關(guān)系，主要有桿菌、球菌、螺旋菌、弧菌和卵菌等[8]，分布在海洋、淡水等水體的沉積物中，豐度高低與沉積物的顆粒大小正相關(guān)[9]。不同類型的MTB所產(chǎn)生的磁性納米顆粒，即BMs的形態(tài)也各不相同，因此不同種類MTB所具有的磁性也有很大差異。此外，其活菌具有一定的高熱適應(yīng)性(活菌可作為研究生物非熱噪音的一種工具)[10]。

MTB產(chǎn)生BMs的過(guò)程稱為生物礦化(圖 1)，雖然其具體機(jī)制尚未得到細(xì)致的解答[11]，但可分為以下幾個(gè)重要階段:(1)細(xì)胞膜內(nèi)陷形成磁小體膜；(2)磁小體鏈的組裝；(3)環(huán)境中游離的鐵離子通過(guò)細(xì)胞膜上的多種跨膜蛋白協(xié)助進(jìn)入磁小體膜內(nèi)[12]；(4)空腔中的鐵離子聚集；(5)鐵離子形成磁鐵礦晶體。MTB內(nèi)部數(shù)量不等的BMs呈長(zhǎng)鏈狀，沿著細(xì)菌體內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲排列[13]，沿長(zhǎng)軸分布。MTB根據(jù)鏈狀BMs提供的磁偶極矩沿著地磁場(chǎng)線運(yùn)動(dòng)，尋找適宜生存的低氧濃度區(qū)域得以存活，將三維空間中的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)變?yōu)檠刂卮艌?chǎng)線的一維運(yùn)動(dòng)，便于尋找適宜的生存區(qū)域[13]，因此其生存區(qū)域常位于有氧無(wú)氧界面，即水與污泥交界面上[5]。在海洋河流等流動(dòng)性的生存環(huán)境中，磁場(chǎng)可使得具有磁性的MTB克服水中的逆流并進(jìn)行長(zhǎng)距離的運(yùn)動(dòng)[14]。由于地理南北極和地磁場(chǎng)南北兩極的劃分，MTB的運(yùn)動(dòng)方向通常有所不同:一般認(rèn)為在北半球分離得到的MTB會(huì)沿著地磁線向地磁南極游動(dòng)，而在南半球分離得到的MTB會(huì)向地磁北極游動(dòng)，處在赤道的MTB具有兩極趨向性。

圖 1 磁小體形成過(guò)程[15]

1.2 趨磁細(xì)菌的分離與篩選技術(shù)

MTB本身以及其產(chǎn)生的BMs具有很高的應(yīng)用價(jià)值，在各領(lǐng)域的需求量逐漸增多，但是細(xì)菌對(duì)于環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)的要求高、生長(zhǎng)速率緩慢、遺傳復(fù)雜性高，人工大量培養(yǎng)困難。并且由于缺乏對(duì)于MTB的篩選，品質(zhì)優(yōu)良且大量的BMs更難得到。因此人們需要提高M(jìn)TB富集、收集和篩選的技術(shù)。首先需要采集泥樣，根據(jù)MTB的生境，一般是在水與污泥交界面取水泥樣品再進(jìn)行富集。當(dāng)前對(duì)于MTB的富集方法主要是利用化學(xué)培養(yǎng)基培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，Blakemore等[16]使用一種以奎尼酸鐵和琥珀酸鹽作為鐵離子來(lái)源和碳源的化學(xué)培養(yǎng)基富集到了淡水湖中的微好氧雙鞭毛磁螺菌，這種培養(yǎng)基沿用至今，可對(duì)好氧及微好氧MTB進(jìn)行分離及純化。實(shí)驗(yàn)室針對(duì)MTB的收集主要有3種方法:一是用根據(jù)Matsunaga的反扣法設(shè)計(jì)的MTB收集器收集[17-19]；二是用磁泳法收集，也可二者聯(lián)用分離出不同種類的MTB[20]；三是電磁誘導(dǎo)法收集，即利用通電螺線管產(chǎn)生磁場(chǎng)誘導(dǎo)MTB的原理進(jìn)行收集[21]。

收集之后需要根據(jù)研究?jī)?nèi)容對(duì)收集到的MTB進(jìn)行篩選。目前篩選MTB的方法一般是通過(guò)電子顯微鏡觀察，并結(jié)合菌落顏色進(jìn)行觀察或使用Cmag法，而分離一般是用磁偶極子或誘導(dǎo)偶極子在磁場(chǎng)梯度的作用下拉下目標(biāo)細(xì)菌。由于MTB的運(yùn)動(dòng)難以準(zhǔn)確控制，會(huì)增加篩選難度。在最近發(fā)表的研究中，Tay等[22]開(kāi)發(fā)了一種可以根據(jù)MTB的表型分離AMB-1的磁棘輪系統(tǒng)，可以自動(dòng)、實(shí)時(shí)、定量篩選MTB。該磁棘輪篩選平臺(tái)使用了高磁導(dǎo)率的鎳鐵導(dǎo)磁合金，合金柱水平排列組成微柱陣列，形成一個(gè)持續(xù)且循環(huán)的磁場(chǎng)，磁場(chǎng)產(chǎn)生的強(qiáng)大移動(dòng)磁勢(shì)陷阱可以捕捉AMB-1從而限制AMB-1的運(yùn)動(dòng)，在棘輪芯片上的AMB-1的傳輸受磁力的平衡控制而減少運(yùn)動(dòng)對(duì)篩選造成的影響。通過(guò)對(duì)磁場(chǎng)磁力的控制，可以篩選出不同類型的MTB。由此篩選得到的AMB-1可含有比一般AMB-1數(shù)量多2.2倍的BMs(大約25個(gè))。

2 磁小體的基本特性及特點(diǎn)

2.1 磁小體的結(jié)構(gòu)及組成

BMs是一種由趨磁細(xì)菌產(chǎn)生的磁性納米粒子，其主要結(jié)構(gòu)分為外部生物被膜與內(nèi)部礦物晶體兩部分。BMs膜主要由磷脂、脂肪酸以及大量與BMs形成相關(guān)的近蛋白質(zhì)(BMs膜蛋白Mam、磁粒子膜蛋白Mms等)組成，與生物體內(nèi)的細(xì)胞膜系統(tǒng)成分相似[23]，是由MTB細(xì)胞膜內(nèi)陷形成。礦物晶體主要是由磁鐵礦(氧化鐵，F(xiàn)e3O4)或膠黃鐵礦(硫化鐵，F(xiàn)e3S4)礦物組成[15]，晶體大小約為30-120 nm，經(jīng)常使用的AMB-1和MSR-1所產(chǎn)BMs晶體直徑為45-55 nm，個(gè)體形狀一致[1]，均為單磁疇磁性顆粒[24]。在高分辨率透射電鏡的觀察下，目前可以培養(yǎng)得到的MTB的BMs晶體結(jié)構(gòu)主要有方形、矩形、六角形或子彈頭形等，而這些結(jié)構(gòu)都是基于立方體、八面體以及十二面體的延伸。不論是氧化鐵晶體還是硫化鐵晶體在室溫下均具有永久磁矩，便于磁化。此外，在BMs中還發(fā)現(xiàn)了一些微量的其他金屬元素的存在，如銅、金和鈣等[25]。

2.2 磁小體的基本特性

BMs獨(dú)特的組成和結(jié)構(gòu)給予其生化上與眾不同的特性，在各領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

2.2.1 磁小體表面膜修飾多樣性與生物相容性

BMs表面包被的生物膜富含磷脂和蛋白質(zhì)，整體帶負(fù)電[26]，目前已有大約30種特異性蛋白被證實(shí)出現(xiàn)在BMs膜上，因而B(niǎo)Ms表面膜結(jié)構(gòu)具有多態(tài)性，可以利用其表面的特異性基團(tuán)進(jìn)行人工修飾使BMs具有不同的功能特性[27]，如利用人血清白蛋白包裹磁鐵礦可以作為藥物的靶向運(yùn)輸載體和磁共振成像(MRI)的增強(qiáng)劑[28]。BMs膜由MTB天然形成，因而與一般的生物膜成分類似，具有很好的生物相容性[29]，可參與藥物靶向治療或癌細(xì)胞檢測(cè)。

2.2.2 磁小體的磁性與磁熱效應(yīng)

BMs在MTB菌體內(nèi)成鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)，使之成為了細(xì)胞的“磁鐵棒”，可以感受地磁場(chǎng)的變化，進(jìn)而對(duì)MTB進(jìn)行地磁導(dǎo)航，使得MTB在水體中長(zhǎng)距離定向運(yùn)動(dòng)甚至克服逆流，此特性不僅可用于研究BMs作為藥物靶向載體在體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)，還可用于研究地球地磁場(chǎng)的變化[30]。BMs還具有超順磁性，即當(dāng)外加磁場(chǎng)時(shí)BMs可以受外加磁場(chǎng)的引導(dǎo)，而撤掉外加磁場(chǎng)后BMs不再受其影響[31]，因而可用作MRI的增強(qiáng)劑[32]。作為鐵磁體的一種，BMs同樣具有磁熱效應(yīng)，即在絕熱的磁場(chǎng)條件下，BMs的溫度隨磁場(chǎng)強(qiáng)度增大而升高，可在癌癥熱療中使用BMs來(lái)提高治療的針對(duì)性。此外，基于法拉第電磁感應(yīng)定律，純化后的BMs和MTB可以在螺線管中發(fā)電[33]。

2.2.3 磁小體的低毒性

BMs在低濃度下不會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成任何影響[34]。目前的研究主要針對(duì)人體紅細(xì)胞、WBC、小鼠巨噬細(xì)胞系(J774)、洋蔥根尖和魚(yú)(Oreochromis mossambicus)等多種模型對(duì)BMs的毒性進(jìn)行評(píng)估。在以上模型中生物體存活率均高于90%。在體外純化和滅菌后的BMs對(duì)于小鼠成纖維細(xì)胞也是無(wú)毒的[35]。此外，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)的研究上，磁性納米顆粒(MNPs)對(duì)于疾病惡性瘧原蟲(chóng)和登革病毒的傳播載體—蚊子的幼蟲(chóng)和蛹都是有毒性的，這些毒性可以幫助研究人員研發(fā)抗疾病傳播的BMs藥物[36]。

2.3 磁小體的獲取方法

以BMs為研究對(duì)象，我們需要得到數(shù)量盡可能多、純化程度高的BMs顆粒。目前被廣泛使用的獲取BMs的方法主要有物理破碎和化學(xué)消化兩種，這兩種方法也可疊加使用。物理破碎的一般流程為使用緩沖液或者蒸餾水將待處理MTB細(xì)胞充分懸浮，使用法式壓榨機(jī)擠破細(xì)胞，之后使用超聲波破碎裝置將細(xì)胞破碎，然后通過(guò)離心外加釤鈷磁鐵的方式除去除BMs以外的其他物質(zhì)，最后收集BMs[35, 37]?；瘜W(xué)消化在物理法的基礎(chǔ)上去掉了破碎的過(guò)程，增加了使用化學(xué)試劑或者酶消化細(xì)胞物質(zhì)的過(guò)程，同樣使用緩沖液或者蒸餾水清洗后離心，磁鐵收集BMs[38-39]。二者聯(lián)用效率更高，如在2011年新發(fā)明的一種純化BMs的方法中，Guo等[39]用高壓勻漿器破壞細(xì)胞，用低功率超聲波和尿素處理BMs，蛋白酶K去除吸附和表面蛋白，電洗液去除核酸；利用該方法可大大減少純化時(shí)間，增加純化效率，也可通過(guò)增加層析柱(磁選柱)來(lái)提高BMs的純化度。如Grünberg等[40]在物理法離心收集沉淀后，增加了一個(gè)MACS柱來(lái)收集BMs，在洗脫的過(guò)程中可以消除靜電吸附造成的污染，提高BMs的純化程度。

3 趨磁細(xì)菌的改造策略

3.1 對(duì)趨磁細(xì)菌及其內(nèi)部磁鐵礦晶體形態(tài)的改造

環(huán)境對(duì)于生物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖影響深遠(yuǎn)，Kundu等[41]研究了環(huán)境中高濃度的鋅和鎳對(duì)MS-1的生長(zhǎng)和BMs形成的影響，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中存在大量的鋅離子時(shí)，MTB的長(zhǎng)度會(huì)隨BMs大小和數(shù)量的增加而增加。鋅作為MTB所需的微量元素，過(guò)高的濃度卻沒(méi)有對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒害作用，根據(jù)這一特性，可以通過(guò)在培養(yǎng)基中添加金屬鹽離子(鋅離子)來(lái)提高M(jìn)TB的質(zhì)量和產(chǎn)量。Tanaka等[42]在研究AMB-1的生物礦化過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中缺失Mms6基因的突變株形成了晶體面較小的長(zhǎng)條形磁鐵礦晶體，而互補(bǔ)組和野生組均形成高度有序的立方八面體晶體，進(jìn)而推測(cè)膜蛋白質(zhì)Mms6在該過(guò)程中負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)BMs晶體形狀，研究表明蛋白質(zhì)通過(guò)對(duì)金屬離子進(jìn)行選擇性結(jié)合，推遲晶體成核反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控BMs形態(tài)大小[43]。通過(guò)人工控制Mms6的表達(dá)和作用，可以達(dá)到改造BMs晶體形狀的目的。

3.2 對(duì)趨磁細(xì)菌組成的改造

相對(duì)于對(duì)BMs膜進(jìn)行修飾，對(duì)MTB膜進(jìn)行改造的研究相對(duì)較少。Chen等[44]根據(jù)MTB的能動(dòng)性和可控性，使用兔抗MO-1細(xì)胞多克隆抗體來(lái)覆蓋MO-1細(xì)胞表面，使用蛋白A來(lái)做連接，制造出了簡(jiǎn)單的磁性細(xì)菌微型機(jī)器人，在微流控芯片中，磁導(dǎo)使這種微型機(jī)器人移動(dòng)到病原菌富集區(qū)，攜帶并分離病原菌。

3.3 在趨磁細(xì)菌培養(yǎng)中摻雜其他金屬

Li等[45]在MTB培養(yǎng)基中添加鈷離子，得到的BMs利用x射線磁性圓二色性(XMCD)分析，得到了金屬鈷摻雜在BMs內(nèi)的有力證據(jù)。該分析表明由于鈷離子在磁鐵礦的八面體位置中取代Fe離子而與BMs內(nèi)部晶體融合在一起，而且鈷在晶體內(nèi)的分布是不均勻的。Tanaka等[46]根據(jù)最小抑制濃度(MIC)系統(tǒng)分析第一次得到了Cu2+在MTB中最高摻雜度為15.6%，且發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下，MTB更易攝取過(guò)渡金屬，可以通過(guò)增加培養(yǎng)環(huán)境中的過(guò)渡金屬離子Mn2+和Co2+的濃度來(lái)提高金屬摻雜度，摻雜金屬鈷培養(yǎng)得到的BMs具有很好的矯頑值和比較低的Verway轉(zhuǎn)變溫度。此外，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加微量鈷可以顯著地促進(jìn)MTB的細(xì)胞生長(zhǎng)和磁體形成[47]。

4 磁小體的功能化策略

4.1 化學(xué)修飾

化學(xué)修飾是指在BMs膜表面連接固定化學(xué)物質(zhì)或?qū)Ms的膜替換為人工合成聚合物。前者主要包括固定化酶，利用交聯(lián)劑連接抗體、藥物，生物素化等，后者主要指BMs重構(gòu)。經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后的BMs，可以定向連接其他物質(zhì)，將其原有的表面修飾能力變得更有針對(duì)性，能夠更好地應(yīng)用于靶向載藥、病原菌與癌細(xì)胞檢測(cè)、生物傳感等方面。

4.1.1 固定化酶

固定化酶技術(shù)是用載體將酶束縛在一定的空間范圍內(nèi)、保留其活性、可反復(fù)利用和回收的一項(xiàng)技術(shù)。因此，固定化酶的載體材料不能影響酶的活性，還要保證回收率。Matsunaga等[38]發(fā)現(xiàn)BMs可以用于固定生物活性物質(zhì)，與先前使用的大尺寸磁性白蛋白微球相比，BMs尺寸小且可受磁場(chǎng)控制，可作為良好的固定化酶載體。其研究團(tuán)隊(duì)使用γ-氨丙基三乙氧基硅烷作為連接物分別在BMs和人工磁鐵礦、鋅鐵氧化顆粒上固定葡萄糖氧化酶和尿酸酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BMs上固定化酶的活性比人工磁鐵礦或鋅鐵氧體顆粒高出整整40倍，而且BMs固定化酶在反復(fù)使用5次后仍保留活性。

4.1.2 交聯(lián)劑-磁小體復(fù)合物

交聯(lián)劑可以作為BMs和特征物質(zhì)之間的黏著劑，對(duì)交聯(lián)劑的要求是:不影響磁BMs和特征物質(zhì)的活性，保證二者的穩(wěn)定連接。針對(duì)不同特征物質(zhì)選用的交聯(lián)劑種類與數(shù)目不同，主要的特征物質(zhì)有抗體、藥物、探針等。Xiong等[48]在之前研發(fā)出高磁化、均勻尺寸和正電荷的氧化鐵磁性納米團(tuán)(MNCs)的基礎(chǔ)之上，生產(chǎn)出了高性能富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的仿生磁小體(IMSs)(圖 2)。使用靜電相互作用，將MNCs與白細(xì)胞膜片段結(jié)合起來(lái)形成具有細(xì)胞同源性的磁性納米顆粒(LMNC)，當(dāng)仿生磁小體在外周血中遇到白細(xì)胞時(shí)就能產(chǎn)生排斥，從而降低富集背景中的白細(xì)胞干擾。在白細(xì)胞膜片段外表面結(jié)合上疊氮化物(N3)，之后使用點(diǎn)擊化學(xué)將二苯環(huán)辛烯組修飾的抗體(DBCO-Ab)結(jié)合到疊氮化物上形成高富集效率的仿生免疫磁小體。大約90%的罕見(jiàn)腫瘤細(xì)胞都能在15 min之內(nèi)富集完畢。Pi等[49]使用化學(xué)吸附法，用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二酰亞胺做化學(xué)鏈接劑鏈接黃曲霉素B1多克隆抗體和BMs來(lái)提取黃曲霉毒素B1。Deng等[26]根據(jù)BMs表面存在大量氨基酸殘基和蛋白質(zhì)，富含磷脂酰乙醇胺而帶負(fù)電的特性，利用雙功能交聯(lián)試劑GP實(shí)現(xiàn)癌癥藥物阿拉伯胞嘧啶糖苷(Ara-C)與BMs表面氨基酸殘基的連接，減少癌癥藥物的副作用。Dai等[50]利用聚乙烯亞胺(PEI)作為交聯(lián)劑合成BMs-PEI-siRNA復(fù)合體。PEI是一種聚合物基體，可以用于傳遞DNA、siRNA以及寡核苷酸；通過(guò)靜電相互作用，將上述基因片段裝載在PEI上，PEI對(duì)siRNA還有保護(hù)作用，可以防止其被核糖核酸酶降解。

圖 2 免疫磁小體（IMSs）的構(gòu)建和CTC富集過(guò)程[48]

4.1.3 生物素化磁小體

利用生物素對(duì)BMs表面進(jìn)行修飾，以鏈酶親和素(STV)為連接體，可將各種生物素化的物質(zhì)連接在BMs上。Ceyhan等[51]利用BMs表面豐富的基團(tuán)對(duì)BMs進(jìn)行了改造，實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸的檢測(cè)(圖 3)。首先BMs表面生物素化:可以使用生物素化的脂質(zhì)生物素-DPPE直接參與脂膜形成，也可以利用NHS-生物素對(duì)BMs表面蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，使其表面攜帶生物素；然后使用STV與生物素進(jìn)行連接，形成STV-biotin-MPs復(fù)合物，接下來(lái)，可以使用生物素化的多種物質(zhì)進(jìn)行連接。例如，生物素化的寡聚核苷酸(DNA)用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)[52]、生物素化的抗體用于制備免疫磁珠[53-54]等，上述連接物質(zhì)還可同時(shí)連接。利用生物素化BMs還可將檢測(cè)SNP的分子探針交聯(lián)在BMs表面，如Ota等[52]設(shè)計(jì)出了僅有9個(gè)堿基長(zhǎng)度且具有特異性的分子探針用于檢測(cè)TGF-β1的SNP并使用NHS-生物素修飾BMs，利用STV將同樣生物素化的DNA固定在BMs表面，隨后Matsunag等[55]利用同樣的修飾方法，基于等位基因特異性寡核苷酸雜交和生物素化BMs顆粒進(jìn)行熱離解曲線分析的半自動(dòng)化系統(tǒng)對(duì)SNP進(jìn)行高通量檢測(cè)，與傳統(tǒng)的基于序列的方法相比，基于半自動(dòng)化的BMs的SNP檢測(cè)系統(tǒng)具有高可靠性。

圖 3 半合成鏈霉親和素-生物素-磁小體模型示意圖[52]

4.1.4 磁小體重構(gòu)

BMs重構(gòu)指的是BMs結(jié)構(gòu)的重新組裝，包括BMs單獨(dú)個(gè)體的重構(gòu)，也包括BMs整體的重構(gòu)，這種重構(gòu)一般是將BMs膜去除后包裹其他聚合物等物質(zhì)，經(jīng)過(guò)重構(gòu)的BMs可獲得某方面的特殊性質(zhì)。Yoza等[56]就將BMs膜去除，使用具有多氨基的3-[2-氨基乙基]-乙基胺基-乙基甲氧基硅烷(AEEA)重新包裹BMs內(nèi)的晶體(圖 4)，使得重構(gòu)后的BMs表面陽(yáng)離子增多，可與帶負(fù)電的DNA充分結(jié)合，DNA提取率高；再使用一種樹(shù)狀的多胺(PAMAM)分子通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在改造后的BMs表面生成一種致密的外胺殼。隨外殼層數(shù)增加，胺濃度上升，進(jìn)而陽(yáng)離子數(shù)目的大量增加有助于生成膠體懸浮液，增加表面積，用于DNA提取。該外殼還可減少BMs之間的聚集，增加分散性。Matsunaga等[57]利用BMs表面蛋白A-LgG的結(jié)合域?qū)⑸锼貥?biāo)記的BMs固定在具有條紋聚苯乙烯微球上，構(gòu)建了微球-磁小體復(fù)合物，以增加其分散性和磁性，這種復(fù)合物的檢測(cè)效率比單獨(dú)使用BMs高，而且檢測(cè)上限大，可用于開(kāi)發(fā)高通量、全自動(dòng)的生物分析工具。

圖 4 重構(gòu)磁小體的結(jié)構(gòu)[56]

（黑色部分：磁體礦晶體；內(nèi)層：AEEA；外層：PAMAM）

4.2 生物修飾

生物修飾主要是將生物成分加工到BMs結(jié)構(gòu)中，或者利用MTB的生物礦化過(guò)程將物質(zhì)帶入BMs內(nèi)部，如通過(guò)蛋白質(zhì)、多肽等代替交聯(lián)劑連接抗體，使BMs表面攜帶綠色熒光蛋白(GFP)等。

4.2.1 蛋白質(zhì)/多肽-磁小體復(fù)合物

在化學(xué)修飾中提到的多種化學(xué)交聯(lián)劑，雖然交聯(lián)能力強(qiáng)，但用量大、價(jià)格昂貴，還存在所連接抗體取向不一，可變區(qū)與BMs連接的問(wèn)題。使用多樣化的蛋白質(zhì)或多肽來(lái)替代交聯(lián)劑也可達(dá)到相近的效果，甚至還可實(shí)現(xiàn)使用交聯(lián)劑達(dá)不到的效果。例如，同樣是連接抗體，可以利用金黃色葡萄球菌的胞壁蛋白蛋白A基因與磁細(xì)菌MSR-1膜上表達(dá)量最多的MamC和表達(dá)量第二多的MamF基因整合后表達(dá)出融合蛋白，重組之后的BMs可以與多數(shù)哺乳動(dòng)物IgG的Fc片段結(jié)合形成功能性BMs[58-59]。Takahashi等[60]通過(guò)使用MmsC-NS多肽鏈融合蛋白的方式將由4個(gè)天冬酰胺和1個(gè)絲氨酸殘基組成的長(zhǎng)度為100個(gè)氨基酸的NS多肽鏈修飾在BMs表面，多肽鏈末端可連接蛋白G，該復(fù)合物增強(qiáng)了BMs的分散性和特異性結(jié)合能力。

4.2.2 熒光蛋白-磁小體復(fù)合物

Lang和Schüler等[61]通過(guò)將GFP基因與相關(guān)蛋白質(zhì)基因共表達(dá)，形成融合蛋白，使BMs表面蛋白質(zhì)攜帶熒光基團(tuán)。小組用這種熒光蛋白-磁小體復(fù)合物，在流式細(xì)胞法、熒光顯微鏡和生物化學(xué)分析等幫助下，研究了微好氧MTB中融合蛋白在BMs中的定位和表達(dá)。該方法克服了相互排斥的高熒光和磁鐵礦合成的矛盾，建立了可以保證MTB正常生長(zhǎng)、正常進(jìn)行生物礦化和GFP熒光團(tuán)正常形成的最佳(氧氣)條件。并在這些優(yōu)化的條件下，利用熒光顯微技術(shù)和免疫印跡技術(shù)，研究了GFP標(biāo)記的MamC，MamF和MamG的胞內(nèi)定位和表達(dá)。其中MamC-GFP表現(xiàn)出最強(qiáng)烈的熒光(表達(dá)量最高)，純化得到的MamC-GFP所標(biāo)記的BMs對(duì)洗滌劑敏感，但在廣泛的溫度和鹽濃度范圍下穩(wěn)定。該研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為GFP融合蛋白熒光標(biāo)記法最適合用于MamC的檢測(cè)。根據(jù)MamC與GFP的高適應(yīng)性，Mickoleit等[62]在基因改造的水平上，利用酶陣列基因表達(dá)，制備出了具有放大催化活性的多功能BMs(圖 5)。他們使用5個(gè)大腸桿菌β-葡糖醛酸酶(GusA)構(gòu)成一個(gè)酶的微陣列，并與熒光團(tuán)mEGFP基因(即細(xì)菌的增強(qiáng)型GFP)、BMs膜表面表達(dá)量最多且具有親水性N端的MamC融合，高度表達(dá)形成雜合蛋白，修飾在BMs表面，3個(gè)蛋白質(zhì)的基因位于同一啟動(dòng)子之后。其中mEGFP蛋白與MamC連接后，可以穩(wěn)定并增強(qiáng)BMs的熒光[63]，MamC起到了膜定位的作用。即使增加GusA單體的數(shù)量也不會(huì)影響B(tài)Ms磁性、熒光以及催化活性的穩(wěn)定性，可為將BMs應(yīng)用于醫(yī)療提供便利。

圖 5 mEGFP-（GusA）s-MamC在磁小體中的基因設(shè)計(jì)（A）和表達(dá)效果（B）示意圖[62]

5 磁細(xì)菌的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用

5.1 在重金屬污染廢水中的應(yīng)用

工業(yè)生產(chǎn)如電鍍、電子設(shè)備制造廠排放廢液中的重金屬離子會(huì)污染環(huán)境(如鉛、銅、鎳和鎘等)，破壞生態(tài)，有時(shí)我們也需要對(duì)廢液中的重金屬離子進(jìn)行二次回收生產(chǎn)其他產(chǎn)品?；瘜W(xué)沉淀法、溶劑萃取法、離子交換法等許多傳統(tǒng)方法都有助于緩解這種危害性。但是當(dāng)金屬離子濃度低于100 mg/L時(shí)，所有這些方法都是高成本且無(wú)效的，有些甚至?xí)斐啥挝廴綶64]。MTB在磁場(chǎng)下可以實(shí)現(xiàn)對(duì)廢液重金屬離子的吸附，這種生物吸附法是環(huán)保的，如MTB對(duì)Pd/AL廢液系統(tǒng)的吸附，無(wú)論是對(duì)Pd2+還是對(duì)AL3+吸附過(guò)程都十分快速，其中對(duì)Pd2+具有優(yōu)先吸附性，二者的吸附均符合擬二階吸附動(dòng)力學(xué)模型。并且隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的增加，分離效果提高的同時(shí)，分離速率也會(huì)顯著提高[65]。此外，MTB還可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cr[66]以及Cu[64]等其他金屬離子的吸附回收。

5.2 在生物學(xué)、地理學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用

在生物學(xué)方面，對(duì)于古MTB化石的研究有助于科學(xué)家探究地球生命的起源問(wèn)題[67]。在地理學(xué)層面，MTB可幫助我們恢復(fù)古環(huán)境、了解沉積剩磁狀況和推測(cè)古地磁方向。在35億-38億年前，古MTB已在地球上出現(xiàn)，其生長(zhǎng)發(fā)育、BMs的生物礦化過(guò)程與環(huán)境密不可分，在地磁場(chǎng)線排列和運(yùn)動(dòng)也與地磁場(chǎng)的變化聯(lián)系緊密。彭先芝等[68]收集了不同環(huán)境黃土剖面L6-S5-L5層段中的MTB，通過(guò)對(duì)其形態(tài)大小、數(shù)量以及BMs結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)MTB的分布與古環(huán)境氣候存在聯(lián)系，并以此推測(cè)出了黃土高原古氣候頻繁波動(dòng)的狀態(tài)和自北向南的變化趨勢(shì)。MTB在醫(yī)學(xué)方面的研究潛力無(wú)限，2014年，Chen等[44]利用金黃色葡萄球菌胞壁蛋白A連接兔抗MO-1細(xì)胞多克隆抗體和磁細(xì)菌MO-1，制造出了簡(jiǎn)單的磁性細(xì)菌微型機(jī)器人。該機(jī)器人可在微流控芯片中，受磁導(dǎo)移動(dòng)到病原菌富集區(qū)，攜帶并分離病原菌。該方案可能將在未來(lái)醫(yī)學(xué)檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。

6 磁小體的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用

6.1 在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

BMs經(jīng)過(guò)功能化修飾后可攜帶抗體成為免疫磁珠，與食品中的病原菌或毒性物質(zhì)特異性結(jié)合達(dá)到分離效果，通過(guò)連接一些檢測(cè)裝置達(dá)到檢測(cè)的效果[69]。Xu等[59]使用生物修飾法構(gòu)建了LgG-SpA(金黃色葡萄球菌胞壁蛋白A)-磁小體復(fù)合物，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)用于檢測(cè)海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌的數(shù)量，結(jié)果表明，一毫克的復(fù)合物能夠捕捉多達(dá)1.74×107個(gè)弧菌細(xì)胞。Pi等[70]利用黃曲霉毒素B1多克隆抗體和BMs制備免疫磁珠探針提取植物油中的黃曲霉毒素B1。他們使用化學(xué)吸附法通過(guò)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二酰亞胺做化學(xué)偶聯(lián)劑連接黃曲霉毒素B1多克隆抗體和BMs，與傳統(tǒng)的Fe3O4磁性納米顆粒-黃曲霉毒素B1抗體探針相比，該免疫磁珠在植物油中對(duì)黃曲霉毒素B1的吸收高出28倍，回收率高達(dá)93.7%；Wu等[71]使用同樣方法構(gòu)建出的葡萄球菌腸毒素B(SEB)抗體-磁小體復(fù)合物可回收并檢測(cè)牛奶中的SEB，檢測(cè)范圍為0.05-5 ng/mL，回收效率高達(dá)118%；Peng等[54]利用免疫磁珠分離技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記DNA適體文庫(kù)作為直接特異性報(bào)告者，快速檢測(cè)了豬仔體內(nèi)的大腸桿菌K88。

6.2 在癌癥治療中的應(yīng)用

BMs具有良好的生物相容性、超順磁性和低毒性，體積微小且均一，相比于人工磁性納米粒子而言，天然產(chǎn)生的BMs在癌癥治療中舉足輕重。BMs不僅僅可以作為MRI的對(duì)比劑，還可以作為MRI的特異性標(biāo)記分子與成像探針[72]。Boucher等[72]使用生物修飾法，構(gòu)建腦瘤整合素合成必需RGD肽表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)BMs表面Mamc-RGD肽融合蛋白的表達(dá)，并使用熒光蛋白作為標(biāo)記基因，增加MRI檢測(cè)腦瘤細(xì)胞的特異性。在交變磁場(chǎng)控制下，BMs可侵入腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。根據(jù)BMs這一特性可以將清除腫瘤細(xì)胞的藥物與BMs結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)藥物靶向運(yùn)輸，增加腫瘤治療的特異性和靶向性。余水生團(tuán)隊(duì)[73]使用BMs靶向運(yùn)輸阿霉素/pHSP70-shPLK1雙重藥物實(shí)現(xiàn)了對(duì)骨肉瘤的治療。利用生物修飾法，他們將構(gòu)建的pHP70-shPLK1載體導(dǎo)入BMs內(nèi)部，并使阿霉素均勻覆蓋在BMs表面，該復(fù)合物可有效降低腫瘤細(xì)胞的增殖、侵染能力，提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率。Deng等[26]利用化學(xué)修飾法通過(guò)雙功能交聯(lián)試劑GP實(shí)現(xiàn)藥物Ara-C與BMs表面氨基酸殘基的連接，減少癌癥藥物的毒性。在磁熱療方面，BMs可充分發(fā)揮它在磁場(chǎng)中的熱特性[74]，增加升溫的針對(duì)性，縮小升溫的范圍，從而提高了腫瘤細(xì)胞的死亡率而減少了副作用，將磁熱療技術(shù)與免疫磁珠聯(lián)用，還可用于體內(nèi)滅菌，Chen等[44]利用該法發(fā)現(xiàn)50%與MTB發(fā)生接觸的金黃色葡萄球菌經(jīng)過(guò)磁熱作用后死亡。

7 總結(jié)和展望

總體來(lái)說(shuō)，目前對(duì)于MTB的改造策略主要通過(guò)改變菌體內(nèi)BMs的形態(tài)和組成等間接達(dá)到改造MTB的目的，且MTB主要用于廢水中重金屬的吸附和去除。對(duì)于BMs的功能化策略，主要分為化學(xué)修飾法和生物修飾法，通過(guò)在BMs膜的表面修飾上各種功能活性基團(tuán)比如酶、抗體、核酸、藥物等將BMs應(yīng)用于醫(yī)療、檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域。

對(duì)MTB直接進(jìn)行改造，可借鑒BMs功能化方法，利用MTB膜表面的活性基團(tuán)在其表面共價(jià)或非共價(jià)修飾上各種物質(zhì)；或采用融合蛋白法，使MTB膜表面上的某一種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或其他生物分子等大量生成，利用MTB膜表面這些大量生成的生物分子來(lái)連接功能活性物質(zhì)；這可大大拓寬MTB的應(yīng)用范圍。另外，目前向MTB的BMs磁鐵礦晶體內(nèi)摻雜金屬仍處于研究階段，且研究主要局限于過(guò)渡金屬，應(yīng)用極少。可使用富含Co2+的培養(yǎng)基得到摻雜金屬Co的BMs；其具有較強(qiáng)的矯頑力，穩(wěn)定性較好，且無(wú)毒害作用，可用于提高磁熱療的效果。

此外，BMs目前主要應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域作為藥物遞送載體、MRI造影劑或成像探針等。而在檢測(cè)領(lǐng)域主要通過(guò)在BMs表面修飾上抗體，利用抗原抗體之間的特異性免疫反應(yīng)來(lái)吸附病原菌、病毒、毒素等靶物質(zhì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)，方法較單一。這是今后基于BMs構(gòu)建檢測(cè)技術(shù)需要克服的關(guān)鍵問(wèn)題之一。抗體穩(wěn)定性較差，易失去活性，制備成本高；而功能核酸穩(wěn)定性好，形式多樣且易于制備。因此，可以利用BMs表面豐富的氨基共價(jià)修飾上核酸并利用BMs的天然磁性實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子、生物小分子等其他靶物質(zhì)的高效檢測(cè)。還可以將功能化BMs與試紙條等檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)靶物質(zhì)的快速檢測(cè)等。

參考文獻(xiàn)：略