金孝偉李哲煜徐翩翩張笑顏任南琪

庫(kù)里連科·維塔利孫凱(哈爾濱工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院,城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱150090)(圣彼得堡國(guó)立大學(xué)地球科學(xué)研究所,圣彼得堡,俄羅斯聯(lián)邦199034)

摘要

發(fā)光細(xì)菌能夠發(fā)出波長(zhǎng)為450~490nm的可見光,其發(fā)光強(qiáng)度隨待測(cè)溶液中毒性物質(zhì)濃度增加而減弱。發(fā)光細(xì)菌法具有簡(jiǎn)單、快速和高穩(wěn)定性等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)急性毒性分析。近年來(lái),隨著微流控技術(shù)微型化、集成化和自動(dòng)化的不斷發(fā)展,基于微流控技術(shù)的發(fā)光細(xì)菌毒性分析裝置的研究越來(lái)越多。與傳統(tǒng)方法相比,微流控型生物傳感器所需菌液少,可以有效地避免人為誤差和外界條件干擾等,靈敏度更高。本文結(jié)合發(fā)光細(xì)菌的特點(diǎn)和發(fā)光機(jī)制,對(duì)微流控型生物發(fā)光傳感器及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

1引言

隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重,當(dāng)今社會(huì)對(duì)環(huán)境污染物的監(jiān)測(cè)需求不斷增加。環(huán)境中的毒性物質(zhì)種類繁多,化學(xué)、物理以及生物檢測(cè)方法被逐步建立,其中建立較早的是化學(xué)方法,檢測(cè)體系相對(duì)完善,可實(shí)現(xiàn)大多數(shù)污染物的定性和定量檢測(cè),但該方法只能獲得所測(cè)污染物的成分及濃度,無(wú)法直觀反映該污染物對(duì)生物體的毒性效應(yīng)。物理方法過(guò)程復(fù)雜,設(shè)備昂貴,多用于大氣和大面積水域污染的遙感監(jiān)測(cè)。生物分析方法利用生物體如微生物、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和魚類等對(duì)環(huán)境中的毒性物質(zhì)變化進(jìn)行評(píng)價(jià),其中,基于微生物的生物分析方法因其簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)毒性檢測(cè)。

發(fā)光細(xì)菌是一種在暗室中能發(fā)出肉眼可見的藍(lán)綠光的細(xì)菌,常用于水質(zhì)毒性檢測(cè)。發(fā)光細(xì)菌的生物毒性檢測(cè)依賴于其對(duì)環(huán)境中污染物的反應(yīng),能夠體現(xiàn)污染物對(duì)生命個(gè)體的影響[1]及毒性效應(yīng)[2],具有簡(jiǎn)便快速、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此,發(fā)光細(xì)菌的生物毒性檢測(cè)被用于各種環(huán)境污染物的毒性分析。Westlund等[3]研究了十余種農(nóng)藥對(duì)費(fèi)氏弧菌的急性和慢性毒性,發(fā)現(xiàn)部分農(nóng)藥15min和30min的EC50值相差幾十倍,說(shuō)明僅考慮15min的EC50值容易低估某些污染物的毒性。Liu等[4]以青?；【鸀槭茉嚿?研究了6種農(nóng)藥的單一及二元聯(lián)合毒性,發(fā)現(xiàn)二元聯(lián)合毒性是否高于單一物質(zhì)毒性主要取決于兩種物質(zhì)間的相互作用,如拮抗效應(yīng)使聯(lián)合毒性下降,協(xié)同效應(yīng)使聯(lián)合毒性增強(qiáng)等。Ding等[5]研究了6種鄰苯二甲酸酯及二價(jià)鎘對(duì)青?；【亩拘宰饔?指出這6種鄰苯二甲酸酯與鎘的二元聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為相加效應(yīng)。發(fā)光細(xì)菌也常被用于評(píng)價(jià)新型材料的生物毒性。Rossetto等[6]利用費(fèi)氏弧菌測(cè)試了納米CuO顆粒與微米CuO顆粒的急慢性毒性,研究結(jié)果表明,納米顆粒的毒性高于微米顆粒的毒性,為納米毒理學(xué)研究提供了一種方法和便利工具。Costa等[7]通過(guò)一種全自動(dòng)流動(dòng)注射分析系統(tǒng)研究了7種離子液體對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性作用,指出離子液體的毒性作用與其結(jié)構(gòu)和組成有關(guān),若陽(yáng)離子含有苯環(huán),其毒性大于不含苯環(huán)的結(jié)構(gòu),而陰離子中含氟結(jié)構(gòu)的毒性大于不含氟結(jié)構(gòu)。

近年來(lái),基于發(fā)光細(xì)菌的生物毒性檢測(cè)方法與微流控技術(shù)結(jié)合,使發(fā)光細(xì)菌的生物測(cè)試方法不斷向便攜化、集成化和智能化方向發(fā)展。微流控技術(shù)是在較小的芯片上完成進(jìn)樣、反應(yīng)、檢測(cè)于一體的分析裝置,具有快速、高效以及耗能低等優(yōu)點(diǎn)。研究人員將基于發(fā)光細(xì)菌的生物測(cè)試方法與微流控技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建出新的生物發(fā)光微分析系統(tǒng),主要由三部分組成:(1)微流控芯片,含有微室陣列和微通道;(2)微室內(nèi)的活細(xì)胞,用于感知目標(biāo)物質(zhì)并反饋為生物發(fā)光信號(hào)的變化;(3)轉(zhuǎn)換器,將生物發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)?；诎l(fā)光細(xì)菌的發(fā)光原理以及微流控的技術(shù)思想,本文對(duì)基于發(fā)光細(xì)菌的微流控型生物傳感器的原理及應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

2發(fā)光細(xì)菌及其發(fā)光機(jī)制

發(fā)光細(xì)菌分布廣泛,主要存在于海洋中,是一種能夠發(fā)出微弱藍(lán)綠可見光的細(xì)菌,其最大發(fā)射波長(zhǎng)在450~490nm之間[8],屬革蘭氏陰性、兼性好氧型細(xì)菌[9]。目前,已知發(fā)光細(xì)菌分為4個(gè)屬:弧菌屬(Vibrio)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和光桿菌屬(Photorhabdus)[10],其中典型菌,如明亮發(fā)光桿菌、費(fèi)氏弧菌和青?；【缺粡V泛應(yīng)用于毒性分析。

發(fā)光細(xì)菌中存在由NAD(P)H:FMN氧化還原酶和熒光素酶組成的酶系統(tǒng),當(dāng)黃素酸(FMN)、輔酶域[NAD(P)H]、八碳以上的長(zhǎng)鏈脂肪醛(RCHO)和分子氧(O2)存在時(shí),酶系統(tǒng)發(fā)出約490nm的光,反應(yīng)方程式如下:

細(xì)菌熒光素酶是一種單加氧酶,能將分子氧(O2)中的一個(gè)氧原子轉(zhuǎn)移到還原型黃素單核苷酸(FMNH2)上,使其氧化成黃素單核苷酸(FMN),另一個(gè)氧原子加到長(zhǎng)鏈脂肪醛(RCHO)結(jié)合生成相應(yīng)的長(zhǎng)鏈脂肪酸。熒光素酶自身無(wú)法催化黃素的還原,因此需要借助輔酶域[NAD(P)H]催化,完成生物發(fā)光過(guò)程。由于FMNH2/FMN也作為細(xì)菌呼吸代謝的重要參與物質(zhì),所以細(xì)菌的發(fā)光反應(yīng)可看作是呼吸作用中電子轉(zhuǎn)移到氧分子的一個(gè)代謝旁路,可以調(diào)節(jié)還原型黃素單核苷酸的水平。在能量代謝或分解代謝的脫H反應(yīng)中,輔酶玉(NAD)接受H之后必須將H轉(zhuǎn)給FMN,將其還原為FMNH2后方能進(jìn)入呼吸產(chǎn)能階段。此時(shí),細(xì)菌熒光素酶類似一個(gè)黃素單加氧酶,或是一種平衡功能的氧化酶,能減少還原型黃素單核苷酸的生成,增加電子代謝通路的還原功能,因此對(duì)細(xì)胞代謝是有利的[11]。分子氧與還原型黃素單核苷酸生成熒光素酶鄄黃素過(guò)氧化物,該過(guò)氧化物降解產(chǎn)生的能量生成單線態(tài)的激發(fā)分子,并在退激時(shí)發(fā)射光子。通常,過(guò)氧鍵斷裂后被兩個(gè)更強(qiáng)的化學(xué)鍵取代,并伴隨著能量的產(chǎn)生,部分能量用于生物發(fā)光。

3基于發(fā)光細(xì)菌的微流控系統(tǒng)

發(fā)光細(xì)菌接觸污染物后,酶系統(tǒng)受到破壞或者細(xì)胞死亡都會(huì)導(dǎo)致其發(fā)光強(qiáng)度下降。部分污染物能夠與發(fā)光細(xì)菌的熒光素酶結(jié)合,從而干擾細(xì)菌的生物發(fā)光過(guò)程;有的污染物則是通過(guò)破壞細(xì)胞表面的感受器,擾亂細(xì)胞膜功能,甚至與細(xì)胞組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞失活從而降低發(fā)光強(qiáng)度。因此,根據(jù)污染物對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度抑制作用的不同,發(fā)光細(xì)菌可以用于評(píng)估污染物的毒性效應(yīng)[12]。

自Karube提出生物傳感器的概念[13],生物傳感器在環(huán)境污染物檢測(cè)方面得到快速發(fā)展,尤其是微流控型生物傳感器備受關(guān)注。基于發(fā)光細(xì)菌的微流控型生物傳感器中,細(xì)菌所處狀態(tài)有多種形式[14],包括處于液體中的懸浮態(tài)(圖1A)、被制作成凍干粉的凍干態(tài)(圖1B)和固定在一次性樣品池、光纖或生物芯片上的固定態(tài)(圖1C),其中常用的是懸浮態(tài)和固定態(tài)。

3. 1搖細(xì)菌固定型微流控生物傳感器

細(xì)菌固定型微流控生物傳感器根據(jù)細(xì)菌固定方式的不同可分為藻酸鈣固定、瓊脂固定以及海藻酸鈉薄片固定等,以下分別對(duì)上述幾種固定方式的生物傳感器進(jìn)行介紹。

Eltzov等[18]研發(fā)了一種檢測(cè)水中有毒污染物的在線光纖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。將分別攜帶recA(DNA損傷)和grpE(熱休克)啟動(dòng)因子的兩株細(xì)菌懸浮液與2%海藻酸鈉溶液按體積比1:1混合均勻后,涂布在光纖頭部,隨后涂布0.5mol/LCaCl2溶液,使其反應(yīng)形成藻酸鈣,將細(xì)菌固定在光纖頭部。作者首先對(duì)系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)行24h所需的條件進(jìn)行優(yōu)化,并在流動(dòng)狀態(tài)下檢測(cè)自來(lái)水和地表水中的污染物。初步實(shí)驗(yàn)表明,添加7.5%的LB培養(yǎng)基是保證設(shè)備在流動(dòng)水體中長(zhǎng)時(shí)間(>1h)運(yùn)行的必要條件。在對(duì)自來(lái)水的水質(zhì)監(jiān)測(cè)中,該系統(tǒng)能夠穩(wěn)定運(yùn)行24h,但在地表河流的水質(zhì)監(jiān)測(cè)中,由于流體不斷沖擊光纖頭部,使其固定的發(fā)光細(xì)菌逐漸減少,系統(tǒng)在運(yùn)行20h后很難對(duì)污染物繼續(xù)產(chǎn)生響應(yīng)。隨后,作者對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行深入優(yōu)化[20],首先調(diào)整培養(yǎng)基成分和濃度,然后通過(guò)在流體出口增加蠕動(dòng)泵的方式研究不同流速對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,并為光纖探針增設(shè)水流緩沖保護(hù)罩以降低流體剪切力,優(yōu)化后的裝置如圖2所示。優(yōu)化后的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)不僅能快速檢測(cè)到水質(zhì)變化,而且將最大流速?gòu)?L/h提高到10L/h,在相同的時(shí)間內(nèi)完成了更大體積量的水樣檢測(cè)。同時(shí),該設(shè)備實(shí)現(xiàn)了對(duì)流動(dòng)水體中的污染物毒性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),可為水源地取水口或飲用水管網(wǎng)等重要節(jié)點(diǎn)的水質(zhì)安全提供早期預(yù)警功能。

圖1基于發(fā)光細(xì)菌的生物傳感器:(A)細(xì)菌懸浮型生物傳感器[15];(B)凍干細(xì)菌型生物傳感器[16];(C)細(xì)菌固定型生物傳感器,(1)細(xì)菌固定在一次性樣品池中[17],(2)細(xì)菌固定在光纖上[18],(3)細(xì)菌固定在生物芯片中[19],(a)加工好的微型細(xì)胞芯片照片,(b)芯片通道及細(xì)菌固定區(qū)的微觀示意圖Fig.1Threekindsofbiosensorsbasedonluminescentbacteria:(A)Biosensorwithbacteriainsuspension[15],(B)Biosensorwithfreeze-driedbacteria[16]and(C)Biosensorwithimmobilizedbacteria.(1)Immobi-lizationofbacteriainadisposablecard[17];(2)Immobilizationofbacteriaontoopticalfibertips[18];(3)Immobilizationofbacteriainthebiochips[19];(a)thephotographofthefabricatedmicro-well-chip,(b)themicroscopicviewofthechannelandtheregionwherethebacteriaisimmobilized

Jouanneau等[17]設(shè)計(jì)了兩種基于發(fā)光細(xì)菌不同保存方式(圖3A)的生物傳感器(“Lumisens芋冶和“Lumisens郁冶),用于在線檢測(cè)環(huán)境樣品中的重金屬。其中,Lumisens芋系統(tǒng)中的細(xì)菌懸浮液與4%的瓊脂糖溶液混勻后,固定在有連續(xù)流驅(qū)動(dòng)的微井中,生物活性較高;而Lumisens郁系統(tǒng)中使用的細(xì)菌在96孔微板中進(jìn)行冷凍干燥,活性相對(duì)較低。兩套系統(tǒng)均封閉于暗箱中,利用CCD相機(jī)對(duì)細(xì)菌發(fā)出的光信號(hào)進(jìn)行圖像捕捉并記錄。在10d內(nèi),作者分別利用兩種生物傳感器連續(xù)檢測(cè)蒸餾水或環(huán)境樣品中的汞(Hg),每天將系統(tǒng)中的發(fā)光細(xì)菌暴露于含有500nmol/LHg的樣品中100min,其余時(shí)間持續(xù)通入細(xì)菌培養(yǎng)液。結(jié)果表明,Lumisens芋系統(tǒng)自啟動(dòng)6h后產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)(圖3B),在測(cè)試的10d內(nèi)生物發(fā)光水平不穩(wěn)定,變化率達(dá)40%,固定化細(xì)菌在第3~6d處于穩(wěn)定生長(zhǎng)階段,生物發(fā)光信號(hào)的重現(xiàn)性和重復(fù)性接近5%。Lumisens郁系統(tǒng)啟動(dòng)1.5h后便可獲得響應(yīng)信號(hào),生物發(fā)光信號(hào)的重現(xiàn)性達(dá)3%,在10d內(nèi)可達(dá)到Hg的穩(wěn)定檢測(cè);在Lumisens芋系統(tǒng)中,細(xì)菌易受到暴露的污染物的影響,導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)菌活性降低,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性;在Lumisens郁系統(tǒng)中,細(xì)菌被限定在微孔板中的各個(gè)微孔中,執(zhí)行獨(dú)立地單次分析,但操作相對(duì)繁瑣,重復(fù)性較低。

圖2優(yōu)化后的水體污染物毒性檢測(cè)傳感器[20](A)系統(tǒng)優(yōu)化后的示意圖;(B)流通室照片;(C)六層藻酸鈣聚合形成的光纖探針Fig.2Biosensorfordetectingwatertoxicityafteroptimization[20](A)Schematicoftheoptimizedbiosensor,(B)Photoofperspexflowunitand(C)Calcium(2%,V/V)-polymerizedalginatewithsixlayersformingthefiberopticprobe

圖3重金屬在線檢測(cè)生物傳感器[17](A)Lumisens芋和Lumisens郁兩種系統(tǒng)中的流體通路示意圖;(B)Lumisens芋系統(tǒng)每天暴露于500nmol/L的汞生物發(fā)光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù),(a)實(shí)驗(yàn)室條件下的兩次測(cè)試結(jié)果對(duì)比,(b)微井中的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(CFU=菌落單位),(c)CCD相機(jī)拍攝的樣品池中固定化細(xì)菌的發(fā)光照片F(xiàn)ig.3Biosensorforonlinedetectionofmetals[17](A)fluidicchartofthetwosystemsLumisens-andLumisens-and(B)real-timemonitoringdataofLumisens-whenexposedtoHg(500nmol/L)daily.(a)Comparisonoftheresultsbetweentwiceexperiments;(b)Growthcurvesofcells(CFU=colonyformingunit);(c)CCDcameraimagingoftheimmobilizedbacteriainmulti-wellcard

Elad等[21]開發(fā)了一種在線連續(xù)監(jiān)測(cè)水質(zhì)毒性的流通式生物傳感器。瓊脂固定化重組發(fā)光細(xì)菌的模塊化生物芯片是該裝置的核心部分,單光子雪崩二極管探測(cè)器(SPAD)為響應(yīng)信號(hào)探測(cè)裝置(圖4A)。作者配備了誘導(dǎo)型和組成型兩種菌株,并在連續(xù)的水流中持續(xù)放置10d,這段時(shí)間里分別連續(xù)通入萘啶酸、百草枯、As髥和上述3種物質(zhì)的混合液以及一個(gè)工業(yè)廢水水樣2h。通過(guò)比較固定態(tài)和懸浮態(tài)下細(xì)菌對(duì)同種濃度污染物的響應(yīng)強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)懸浮態(tài)的細(xì)菌對(duì)污染物的靈敏度更高,但穩(wěn)定性略低于固定態(tài),且重復(fù)性接近20%。該傳感器對(duì)6和0.01mg/L的As髥以及0.02和0.005mg/L的Sb髥(圖4B)具有很好的識(shí)別作用,且檢測(cè)濃度滿足美國(guó)和歐盟飲用水水質(zhì)安全標(biāo)準(zhǔn)的檢出限要求。該生物傳感器能夠在0.5~2.5h內(nèi)檢測(cè)到所有的模擬污染事件,并根據(jù)污染性質(zhì)反饋特定的響應(yīng)信號(hào),可用于防止有毒化學(xué)品意外泄露或水源地有毒物質(zhì)故意投放等預(yù)警系統(tǒng),并與相關(guān)物化方法互補(bǔ),構(gòu)成水質(zhì)安全保障網(wǎng)絡(luò)。

圖4流通式生物傳感器示意圖及響應(yīng)曲線[21](A)流通室頂視圖,單光子雪崩光電二極管、步進(jìn)軸、流通室的橫斷面;每個(gè)流通室都是三層結(jié)構(gòu),由玻璃、PDMS和PMMA組合而成,形成一個(gè)含有12個(gè)微井的通道;(B)砷和銻的響應(yīng)曲線Fig.4-Schematicofflow-throughbiosensor[21](A)Topviewoftheflow-throughchambers,thesinglephotonadvanceddiode(SPAD)detectors,thestepperaxis,across-sectionofaflow-throughchamber.Eachflow-throughchamberisconstructedofthreelayers(glass,PDMSandPMMA),whichformsaflowchannelwith12wellsinitspath;(B)ResponsecurvesofAsandSb

近年來(lái),基于發(fā)光細(xì)菌的生物傳感器對(duì)于水質(zhì)毒性檢測(cè)的研究較多,用于氣體毒性檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道較少。Eltzov等[22]設(shè)計(jì)的空氣毒性檢測(cè)傳感器在室內(nèi)空氣毒性監(jiān)測(cè)方面表現(xiàn)優(yōu)異,該系統(tǒng)的核心部分主要包括:(1)光電倍增管,用于檢測(cè)細(xì)菌的響應(yīng);(2)液體光導(dǎo)管,用于光信號(hào)傳輸;(3)海藻酸鈉薄片,用于固定細(xì)菌。傳感器示意圖如圖5所示。作者將grpE啟動(dòng)因子改造后的大腸桿菌培養(yǎng)液與過(guò)濾滅菌的2%(w/V)低粘度海藻酸鈉溶液以體積比1頤1混合,在直徑為0.6mm的圓柱體中滴入0.5mmol/LCaCl2溶液30滋L及海藻酸鈉與發(fā)光細(xì)菌的混合液50滋L,制成固定薄片。作者首先對(duì)細(xì)菌固定薄片進(jìn)行優(yōu)化,將細(xì)菌固定薄片放入20mL管中并在其附近滴加1滋L氯仿,通過(guò)研究細(xì)菌固定薄片的不同朝向位置、環(huán)境溫度以及暴露時(shí)間對(duì)傳感器靈敏度的影響,發(fā)現(xiàn)正面朝向可以提高化學(xué)物質(zhì)擴(kuò)散到基質(zhì)中的擴(kuò)散速率,表明升高環(huán)境溫度或延長(zhǎng)暴露時(shí)間可以提高細(xì)胞的響應(yīng)強(qiáng)度。隨后,研究人員

在一間辦公室里放入集成好的裝置,將幾種空氣中常見的污染物,如香煙的煙霧、丙酮和油漆(含有三氯甲烷)等釋放進(jìn)房間,記錄生物傳感器對(duì)各種污染物的響應(yīng)程度。研究表明,生物傳感器對(duì)幾種污染物的響應(yīng)結(jié)果顯示了其對(duì)室內(nèi)環(huán)境中有毒物質(zhì)的響應(yīng)能力,其中對(duì)丙酮的響應(yīng)最為強(qiáng)烈,對(duì)油漆中的三氯甲烷次之。

雖然生物傳感器和傳統(tǒng)的分析方法都能夠定性分析空氣樣品中的污染物類型,但傳統(tǒng)方法仍然存在價(jià)格昂貴、需要特殊的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備以及不適于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等問(wèn)題,且所需操作人員技術(shù)要求嚴(yán)格是阻礙傳統(tǒng)方法在毒性監(jiān)測(cè)中廣泛應(yīng)用的最大問(wèn)題。與之相反,生物傳感器操作簡(jiǎn)單、靈敏便捷,對(duì)構(gòu)建新型空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)裝置具有重要的指導(dǎo)意義。

圖5空氣毒性檢測(cè)傳感器示意圖及其對(duì)丙酮和三氯甲烷的檢測(cè)結(jié)果[22]:(A)傳感器示意圖;(B)傳感器對(duì)丙酮和三氯甲烷的響應(yīng)曲線,(1)傳感器對(duì)辦公室釋放2mL丙酮時(shí)的響應(yīng),(2)傳感器對(duì)辦公室釋放5和10mL三氯甲烷的響應(yīng)

Fig.5Biosensorfordetectingairtoxicity[22]:(A)Schemeofthebiosensorand(B)responsecurvesofthebiosensorexposedtoacetoneandchloroform.(1)Responseofthebiosensortothe“spillingaccidents冶of2mLofacetoneinofficeroom;(2)Responseofthebiosensortothe“spillingaccidents冶of5and10mLofchloroforminofficeroom

細(xì)菌固定化雖然可以限制細(xì)菌向周圍環(huán)境中擴(kuò)散,且可以在污染物移除后繼續(xù)重復(fù)利用某些生物元素,提高生物傳感器的使用壽命。但這種方法在原位應(yīng)用中存在一些問(wèn)題,如固定的細(xì)菌會(huì)隨著時(shí)間的推移發(fā)生變化,影響對(duì)污染物的響應(yīng);由于細(xì)菌的擴(kuò)散和游動(dòng)受到限制,使其與污染物的接觸不夠充分,從而導(dǎo)致實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中的檢測(cè)信號(hào)較低;用于固定細(xì)菌的一次性芯片需要頻繁更換,因而在快速檢測(cè)大量污染物時(shí)消耗量較大。因此,對(duì)于短時(shí)間內(nèi)的連續(xù)快速檢測(cè)而言,懸浮型的生物傳感器更具優(yōu)勢(shì)。

3.2細(xì)菌懸浮型微流控生物傳感器

1996年,Gu等[23]最先制作出一種用于測(cè)試細(xì)胞對(duì)有毒物質(zhì)響應(yīng)的連續(xù)流微型生物反應(yīng)器,該微型反應(yīng)器類似一個(gè)沒(méi)有探針控制的簡(jiǎn)化生物培養(yǎng)反應(yīng)器。在連續(xù)流的培養(yǎng)狀態(tài)下,重組生物發(fā)光大腸桿菌可以保持最佳的生理狀態(tài)。這種微型生物反應(yīng)器的容積約58mL,可以長(zhǎng)期連續(xù)操作,具有較高的穩(wěn)定性和可靠性。作者研究了在連續(xù)流狀態(tài)下重組生物發(fā)光大腸桿菌對(duì)乙醇的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)菌發(fā)光水平取決于菌液的最終稀釋倍數(shù)。高稀釋倍率下的發(fā)光細(xì)菌處于非?；钴S的代謝狀態(tài),對(duì)環(huán)境的刺激響應(yīng)較為迅速,菌液的稀釋倍數(shù)越高,反應(yīng)器的靈敏度越高,響應(yīng)越快。1999年,多通道形式的微型反應(yīng)器得以進(jìn)一步開發(fā)制作,其主要包括兩個(gè)反應(yīng)器:一個(gè)用于維持細(xì)菌處于穩(wěn)定狀態(tài),并向另一個(gè)反應(yīng)器持續(xù)供應(yīng)新鮮細(xì)菌;另一個(gè)用于發(fā)光細(xì)菌與待測(cè)物質(zhì)的接觸混合,完成檢測(cè)分析[24]。但是由于該系統(tǒng)細(xì)菌未被固定,因此無(wú)法保證檢測(cè)的穩(wěn)定性。

2003年,Thouand等[25]開發(fā)了一種基于三甲基錫誘導(dǎo)發(fā)光的基因工程發(fā)光細(xì)菌生物傳感器。細(xì)菌在一個(gè)容積約100mL的專用生物反應(yīng)器中培養(yǎng),反應(yīng)器頂部設(shè)有培養(yǎng)基和待測(cè)物質(zhì)的出入口,并插入傳感器實(shí)時(shí)測(cè)量反應(yīng)器內(nèi)的pH值、溫度、溶解氧和細(xì)胞密度,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。為了篩選用于傳感器的最佳培養(yǎng)基,作者分別利用肉湯培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌,在培養(yǎng)進(jìn)入指數(shù)期后,均加入0.001~10.0滋mol/L三甲基錫進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果表明,采用葡萄糖培養(yǎng)基,且三甲基錫達(dá)到1.5滋mol/L時(shí),細(xì)菌的發(fā)光最強(qiáng),隨著樣品濃度增加,毒性增大,發(fā)光強(qiáng)度降低;在采用肉湯培養(yǎng)基過(guò)程中,三甲基錫濃度為10滋mol/L時(shí),發(fā)光強(qiáng)度最大,并且其發(fā)光強(qiáng)度只有前者的1/4。該系統(tǒng)主要特點(diǎn)在于:(1)光纖被固定于反應(yīng)器蓋子上,不與細(xì)菌和樣品接觸,避免了生物膜形成可能導(dǎo)致的光輸出損失;(2)引入多個(gè)微探針以評(píng)估細(xì)菌連續(xù)生長(zhǎng)過(guò)程中的活性;(3)設(shè)備具有自動(dòng)化、集成化、便攜等優(yōu)點(diǎn)。但該生物傳感器檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),通量低。

Zhao等[26]研發(fā)了一種基于發(fā)光細(xì)菌的飲用水中毒物檢測(cè)的微流控裝置,該裝置以費(fèi)氏弧菌為受試生物,監(jiān)測(cè)水中潛在的重金屬離子和苯酚等細(xì)胞毒性物質(zhì),且配有獨(dú)立的細(xì)菌連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。如圖6所示,其芯片包括兩個(gè)逆流混合器和一個(gè)T型液滴生成器,以及6個(gè)螺旋微通道,此設(shè)計(jì)可實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的連續(xù)檢測(cè)。將細(xì)胞懸浮液和水樣引入微混合器中充分混合,隨后分散到氣流中生成氣包水液滴,保證傳感器內(nèi)的發(fā)光細(xì)菌可以獲得充足的養(yǎng)分供應(yīng)。作者選擇Cu2+、Zn2+、重鉻酸鉀以及3,5鄄二氯苯酚作為典型毒物進(jìn)行測(cè)試,以驗(yàn)證系統(tǒng)靈敏度。在測(cè)試過(guò)程中,Zn2+的濃度與相對(duì)發(fā)光單位之間存在非線性關(guān)系。初步測(cè)試表明,該系統(tǒng)只能對(duì)水中簡(jiǎn)單有毒化學(xué)物質(zhì)的濃度進(jìn)行粗略估計(jì),不能識(shí)別或量化特定污染物,但可在大量待測(cè)樣品中快速篩選有毒物質(zhì),其作為一種有效的急性毒性毒物篩選工具,具有良好的應(yīng)用前景。

圖6水質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)示意圖[26]:(A)液滴流由LOC芯片生成,并流動(dòng)到觀察室,PMT在觀察室頂部收集發(fā)光信號(hào);(B)觀察室的動(dòng)態(tài)圖,液滴從LOC芯片中不斷流入觀察室,在短時(shí)間內(nèi),觀察室內(nèi)的緩沖液被細(xì)菌和污染物的混合液完全取代,每隔一段時(shí)間對(duì)觀察室的發(fā)光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)Fig.6Schematicofwaterqualitydetectionsystem[26]:(A)Thedropletflowisgeneratedbycell-basedLOCandmovedintoobservationchamber,PMTislocatedontopoftheobservationchamber;(B)Dynamicdiagramofobservationchamber,thedropletsflowfromcell-basedLOCthroughobservationchambercontinuously,thebufferwillbereplacedbythemixtureofbacteriacellsandcontaminantswithinashortperiod

4基因操控以提高發(fā)光細(xì)菌生物傳感器性能

重組的發(fā)光細(xì)菌是通過(guò)向宿主細(xì)胞插入或轉(zhuǎn)染攜帶啟動(dòng)子和目的基因(lux基因)的質(zhì)粒構(gòu)建而成。啟動(dòng)子負(fù)責(zé)特異性識(shí)別,目的基因指導(dǎo)氧化熒光素酶的合成,使重組細(xì)菌具有發(fā)光性能[27]。啟動(dòng)子是位于編碼基因前端的非編碼DNA序列,在RNA聚合酶識(shí)別后其下游基因的轉(zhuǎn)錄得以啟動(dòng)。因此,為提高發(fā)光細(xì)菌生物傳感器的整體分析性能,研究人員通常對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分子改造。

根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的性質(zhì),研究人員已經(jīng)構(gòu)建了大量含有不同啟動(dòng)子的工程菌株。不同來(lái)源的生物發(fā)光基因在導(dǎo)入細(xì)菌過(guò)程中都必須考慮其具體特性,例如,在費(fèi)氏弧菌的發(fā)光基因植入大腸桿菌的過(guò)程中,費(fèi)氏弧菌中熒光素酶保持活性所需溫度低于大腸桿菌(37益)。而研究發(fā)現(xiàn),明亮發(fā)光桿菌則與大腸桿菌保持活性所需溫度一致,因此研究人員將其發(fā)光基因轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中,進(jìn)而獲得了更短的響應(yīng)時(shí)間[28,29]。Yagur鄄Kroll等[30]提出了4種通過(guò)操控啟動(dòng)子來(lái)增強(qiáng)發(fā)光細(xì)菌生物傳感器性能的方法:(1)修改包含啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段的長(zhǎng)度;(2)通過(guò)定向進(jìn)化過(guò)程引入一個(gè)隨機(jī)基因突變體;(3)在啟動(dòng)子序列中引入更多特定的位點(diǎn)突變體;(4)復(fù)制啟動(dòng)子序列,以增加RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)這四種方法,可顯著提高生物傳感器的靈敏度、響應(yīng)時(shí)間以及發(fā)射光強(qiáng)度。

發(fā)光細(xì)菌含有使其發(fā)光的lux操縱子luxCDABEG,其中,luxA和luxB基因分別負(fù)責(zé)細(xì)菌熒光素酶中的琢亞基和茁亞基的編碼,而luxC、luxD、luxE基因則負(fù)責(zé)脂肪酸還原酶中r、s、t多肽的編碼,luxG負(fù)責(zé)黃素還原酶的基因編碼[31]。從不同種類發(fā)光細(xì)菌中分離出的lux基因種類與數(shù)量并不完全相同,但以上提到的6個(gè)基因中,luxC、luxD、luxA、luxB和luxE存在于已發(fā)現(xiàn)的所有發(fā)光細(xì)菌中,其中l(wèi)uxG基因在發(fā)光桿菌屬的lux操縱子中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。到目前為止,發(fā)光細(xì)菌的lux基因常被用于制造重組細(xì)菌來(lái)進(jìn)行生物測(cè)試,從而提高生物發(fā)光強(qiáng)度,降低檢測(cè)限,并且縮短響應(yīng)時(shí)間。

細(xì)菌中lux基因受上游啟動(dòng)子序列的調(diào)控,因此,提高生物發(fā)光性能除了可以對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分子調(diào)控外,還可以通過(guò)拆分lux基因來(lái)實(shí)現(xiàn)[32]。luxCDABE可分成兩個(gè)較小的基因片段,即luxAB和luxCDE,前者負(fù)責(zé)熒光素酶的編碼,后者負(fù)責(zé)指導(dǎo)合成生物發(fā)光反應(yīng)所需要的長(zhǎng)鏈脂肪醛。對(duì)這兩個(gè)基因片段進(jìn)行修飾,使其處于誘導(dǎo)型應(yīng)激反應(yīng)啟動(dòng)子或合成的組成型啟動(dòng)子的控制下。研究人員通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)型或組成型的luxAB與誘導(dǎo)型或組成型的luxCDE進(jìn)行多種組合后,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型luxAB和組成型luxCDE是最佳組合方式,這種組合方式能夠增強(qiáng)細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度,加快反應(yīng)速度。

隨著基因工程技術(shù)逐漸成熟,將攜帶lux基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到非發(fā)光細(xì)菌中的方法已被廣泛使用。研究人員可根據(jù)特定污染物選擇適合的細(xì)菌進(jìn)行基因改造,獲得特異性重組的發(fā)光細(xì)菌,進(jìn)而獲得更高靈敏度,更寬響應(yīng)范圍的發(fā)光細(xì)菌生物傳感器。但是基因工程菌的生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)條件和規(guī)律是否變化,對(duì)污染物毒性檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性是否有提高,以及需要何種條件的污染物誘導(dǎo)亟待進(jìn)一步研究。因此,借助微流控技術(shù)的微腔室、微混合器與多種多樣的原位檢測(cè)技術(shù)帶來(lái)的微環(huán)境梯度形成與高通量等特點(diǎn),將大大加快優(yōu)化條件的篩選過(guò)程。

5結(jié)語(yǔ)

發(fā)光細(xì)菌法因其靈敏度高、反應(yīng)速度快、操作簡(jiǎn)便以及容易實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)等特點(diǎn)在水質(zhì)急性毒性檢測(cè)方面發(fā)揮著巨大作用,其與光纖技術(shù)、傳感技術(shù)以及微流控技術(shù)的結(jié)合可以靈活應(yīng)對(duì)各種復(fù)雜的檢測(cè)環(huán)境。發(fā)光細(xì)菌毒性分析方法適用于快速篩選大量樣品,將其與其它分析方法相結(jié)合,可對(duì)樣品進(jìn)行深度檢測(cè)以提供全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。基于發(fā)光細(xì)菌的各類生物傳感器將在防止有毒化學(xué)物質(zhì)故意或意外滲入到地表水或市政水網(wǎng)等系統(tǒng)的應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用,為環(huán)境安全提供保障。

分子生物學(xué)的發(fā)展有望使發(fā)光細(xì)菌針對(duì)特定污染物產(chǎn)生特異性響應(yīng),擴(kuò)充發(fā)光細(xì)菌的應(yīng)用范圍。將發(fā)光細(xì)菌與先進(jìn)的材料、設(shè)備或技術(shù)(如微/納流體、先進(jìn)的光學(xué)材料等)相結(jié)合以提高整個(gè)測(cè)試系統(tǒng)的效率,也將成為其發(fā)展的一個(gè)重要方向。此外,微通道內(nèi)的高壓強(qiáng)與低溶解氧環(huán)境對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響仍然存在,微流控技術(shù)中微納氣泡的生成和操控將是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。

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